劉婉婷， 錢(qián)詩(shī)蕾， 袁小澎

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部(廣東廣州 510280)

1990—2010年間，全球慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)死亡人數(shù)幾乎翻了一番[1]。根據(jù)2013年的一篇報(bào)道，CKD在全球范圍內(nèi)的流行率達(dá)到8%～16%[2]。腎纖維化是各種類型CKD發(fā)展至終末期腎病的共同通路。腎纖維化的嚴(yán)重程度與腎功能減退具有密切的關(guān)系。因此，了解腎纖維化的發(fā)病機(jī)制有助于減緩和逆轉(zhuǎn)CKD的進(jìn)展過(guò)程，提高CKD患者的生存質(zhì)量。近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)已成為腎纖維化研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。通過(guò)對(duì)表觀遺傳學(xué)的研究，有助于同行更深入地了解腎纖維化的發(fā)病機(jī)制，為今后對(duì)腎纖維化的靶向治療提供新的思路。

1 腎纖維化與表觀遺傳學(xué)概述

腎纖維化的主要病理特征是腎小管破壞、成纖維細(xì)胞增殖活化以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix, ECM)積聚。腎纖維化是多因素驅(qū)動(dòng)的病理過(guò)程，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、成纖維細(xì)胞活化以及上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化等。腎纖維化的持續(xù)發(fā)展將促進(jìn)腎臟器官結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，導(dǎo)致腎功能衰竭，最終嚴(yán)重威脅人類健康和生命。

學(xué)者們對(duì)腎纖維化機(jī)制的研究不僅僅限于這些病理過(guò)程，近年來(lái)眾多研究還發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在腎纖維化的發(fā)病過(guò)程中扮演著極其重要的角色。表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列不發(fā)生改變的前提下，基因表達(dá)發(fā)生了可遺傳改變，同時(shí)引起表型的可遺傳變化。表觀遺傳調(diào)控的方式主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA(MicroRNA，miRNA)修飾等。通常來(lái)說(shuō), DNA 甲基化、組蛋白和miRNA這三者的作用是相對(duì)獨(dú)立的, 但是在某些情況下也會(huì)產(chǎn)生相互作用從而形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。除了腎臟之外，研究還發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在其他器官組織纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起著一定的作用，比如肝臟、肺、心臟、小腸、皮膚[3]。

2 DNA甲基化與腎纖維化

2.1 DNA甲基化 DNA甲基化是指胞嘧啶環(huán)C5位置在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltransferases，DNMTs)的催化作用下添加一個(gè)甲基，產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶。DNMTs是調(diào)控DNA甲基化的關(guān)鍵酶。目前，在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了DNMT蛋白家族的5個(gè)成員，分別是DNMT-1、DNMT-2、DNMT-3a、DNMT-3b和DNMT-3L，其中只有3個(gè)成員具有甲基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，分別是DNMT-1、DNMT-3a和DNMT-3b。它們?cè)诨蚪M中發(fā)揮特定的作用，比如，DNMT-1主要參與維持甲基化，而DNMT-3a和DNMT-3b在胚胎發(fā)育過(guò)程中負(fù)責(zé)從頭甲基化。DNA甲基化水平主要由甲基化和去甲基化兩個(gè)過(guò)程協(xié)同調(diào)控，進(jìn)而動(dòng)態(tài)影響基因表達(dá)的變化以及從發(fā)育到疾病的各個(gè)過(guò)程。

2.2 腎纖維化中的DNA甲基化修飾 Bechtel等[4]表明Rasal1(Ras GTPpase-activating like protein 1, Rasal1)基因甲基化是成纖維細(xì)胞持續(xù)增殖并造成腎纖維化的主要原因，通過(guò)葉酸誘導(dǎo)的小鼠腎纖維化模型發(fā)現(xiàn)DNMT-1表達(dá)增加，在使用脫甲基化試劑5-氮雜胞苷處理后減輕了腎纖維化的程度，從而證明了基因啟動(dòng)子異常甲基化參與了腎纖維化中的發(fā)展過(guò)程。此外，Tampe等[5]研究也發(fā)現(xiàn)5-氮雜胞苷能糾正啟動(dòng)子的異常甲基化使其發(fā)生脫甲基化，再次證明腎纖維化與Rasal1基因異常甲基化以及后續(xù)的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)?；騿?dòng)子發(fā)生異常甲基化不僅僅驅(qū)動(dòng)了腎纖維化的發(fā)生，研究還表明在小梁網(wǎng)組織纖維化[6]、肝纖維化[7]、肺纖維化[8]、心臟纖維化[9]和胃癌[10]的發(fā)展過(guò)程中，都有著不同程度的基因甲基化現(xiàn)象?？偟膩?lái)說(shuō)，基因啟動(dòng)子異常甲基化參與了多種器官組織纖維化發(fā)生和癌癥形成的過(guò)程。去甲基化試劑如5-氮雜胞苷[4-5]已經(jīng)被證明在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中能夠起到治療腎纖維化的作用，但是去甲基化試劑治療也伴隨著一定的細(xì)胞毒性，并且對(duì)全基因組去甲基化的長(zhǎng)期影響是未知的，后續(xù)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)可以適當(dāng)延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期并評(píng)估該試劑的毒理作用。

除了Rasal1基因之外，還有Klotho基因在腎纖維化中發(fā)揮著重要作用。Klotho是一種腎臟特異性抗衰老蛋白，具有保護(hù)腎臟和抗纖維化的功能[11]。研究通過(guò)miRNA干擾和藥物阻斷證實(shí)了Klotho基因在單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral ligation，UUO)誘導(dǎo)的腎纖維化中起著重要作用[12]。Zhang等[13]研究表明在纖維化腎臟中的Klotho表達(dá)缺失與DNMT-1和DNMT-3引起的Klotho啟動(dòng)子甲基化有關(guān)，大黃素通過(guò)影響這些表觀遺傳學(xué)改變從而抑制了腎纖維化，揭示了靶向Klotho表觀遺傳干預(yù)對(duì)腎纖維化疾病具有一定的治療作用。

3 組蛋白修飾與腎纖維化

3.1 組蛋白修飾 在真核生物中，DNA與組蛋白包繞在一起。核心組蛋白通常由H2A、H2B、H3和H4組成。組蛋白修飾是指組蛋白在相關(guān)酶的作用下發(fā)生甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化和腺苷酸化等修飾的過(guò)程。組蛋白修飾中最常見(jiàn)的形式是甲基化和乙酰化。組蛋白甲基化是由組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成的，甲基化可發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上，而且賴氨酸殘基能夠發(fā)生單甲基化、雙甲基化和三甲基化，而精氨酸殘基能夠發(fā)生單甲基化和雙甲基化。組蛋白乙?；饕l(fā)生在H3、H4的N端賴氨酸位置上，是在組蛋白乙?；?Histone deacetylases，HDACs)和組蛋白去乙酰化酶的協(xié)調(diào)作用下進(jìn)行。相對(duì)而言，組蛋白甲基化修飾是最穩(wěn)定的，而乙酰化修飾具有較高的動(dòng)態(tài)，另外還有其他不穩(wěn)定的修飾方式，如磷酸化、泛素化和腺苷酸化等，這些修飾更為靈活地影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，從而發(fā)揮調(diào)控功能。

3.2 腎纖維化中的組蛋白修飾 組蛋白甲基化是通過(guò)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶使組蛋白的賴氨酸(K)或精氨酸(R)殘基上發(fā)生甲基化，而組蛋白3尾(H3)中的第九賴氨酸(K9)特別易于修飾，組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶比如G9a是H3K9發(fā)生單甲基化和雙甲基化的關(guān)鍵酶[14]。Irifuku等[15]研究發(fā)現(xiàn)G9a誘導(dǎo)的H3K9單甲基化在腎纖維化進(jìn)展中具有重要作用，還發(fā)現(xiàn)H3K9單甲基化能調(diào)節(jié)Klotho啟動(dòng)子的活性，提示抑制G9a可作為治療CKD的有效手段。組蛋白甲基化能被抑制劑所逆轉(zhuǎn)，因此通過(guò)抑制組蛋白甲基化治療腎纖維化具有廣闊的研究前景。Sun等[16]研究表明在糖尿病腎病模型中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor beta, TGF-β1)能誘導(dǎo)ECM表達(dá)，伴隨著H3K4單甲基化、H3K4雙甲基化和H3K4三甲基化水平的升高，以及H3K9雙甲基化、H3K9三甲基化水平的降低，該結(jié)果說(shuō)明抑制組蛋白甲基化修飾起到保護(hù)腎臟的作用。此外，H3K9也可以發(fā)生乙?；?，Hewitson 等[17]研究為腎纖維化發(fā)展過(guò)程中H3K9修飾的動(dòng)態(tài)變化提供了證據(jù)。目前，人們對(duì)組蛋白修飾的研究主要集中于對(duì)組蛋白去乙酰酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)治療效果方面的探索。在小鼠腎纖維化UUO模型中，HDACIs明顯抑制了腎纖維化，表明組蛋白乙?；兔撘阴；揎梾⑴c了腎纖維化的發(fā)展[18]。Choi等[19]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗纖維化的作用，并且與HDAC4和HDAC5的下調(diào)有關(guān)，因此，白藜蘆醇有可能是一種潛在的治療藥物。

盡管目前已經(jīng)有很多關(guān)于HDACIs應(yīng)用于腫瘤的臨床試驗(yàn)報(bào)道，但還沒(méi)有HDACIs用于治療CKD患者的臨床試驗(yàn)[20]。因此，在未來(lái)需要進(jìn)一步研究HDACIs在CKD模型中的機(jī)制、功效和毒性，將有助于啟動(dòng)臨床試驗(yàn)以評(píng)估HDACIs在治療CKD中的可行性。

4 miRNA 修飾與腎纖維化

4.1 miRNA修飾 miRNA是一種短的非編碼短核苷酸RNA，長(zhǎng)度約為22 bp，起著轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的作用[21]。miRNA常與內(nèi)含子結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[22],使細(xì)胞獲得更為穩(wěn)定的基因沉默，這種長(zhǎng)時(shí)期的基因沉默可以通過(guò)細(xì)胞分裂得到遺傳。因此，RNA沉默控制了許多相關(guān)功能基因的表達(dá)，成為一種調(diào)控基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)活性的機(jī)制。miRNA已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)方向，并被廣泛應(yīng)用于腫瘤及其他疾病的研究。

4.2 腎纖維化中的miRNA改變 很多研究證明miRNAs參與多種病理和生理過(guò)程，如器官形成[23]、胚胎發(fā)育[24]、腫瘤發(fā)生[25]和纖維化[26]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)提示miRNAs在腎臟疾病中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，比如miRNA-21[27]、miRNA-192[28]、miRNA-200a[29]和miRNA-433[30]。在糖尿病腎病中，miRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[31]。K?lling等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病小鼠模型中，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明miR-21拮抗劑能減少系膜的擴(kuò)張、間質(zhì)纖維化、巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和足細(xì)胞缺失，以及抑制纖維化和炎癥基因的表達(dá)，此外，miR-21沉默顯著提高了Alport小鼠的存活率并減輕了腎小球硬化、間質(zhì)纖維化、小管損傷和炎癥的程度[33]，以上均揭示了miR-21拮抗劑有可能是CKD包括糖尿病腎病和Alport腎病的一種潛在治療方案。此外，miRNA與DNA甲基化和組蛋白修飾等可相互影響，從而在腎纖維化的發(fā)展中發(fā)揮作用。

5 展望

表觀遺傳學(xué)的出現(xiàn)讓人們對(duì)遺傳學(xué)和基因?qū)W之間的關(guān)系有了全新的思考。通過(guò)對(duì)腎纖維化的表觀遺傳學(xué)研究，可以讓我們更清楚地了解到腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，但目前還有許多未解決的問(wèn)題，比如，除了Rasal1和Klotho基因甲基化參與腎纖維化的發(fā)展之外，是否還有別的特定基因也參與其中需要科研工作者的不斷探索；不同纖維化的器官組織之間是否存在共同的基因發(fā)生甲基化也需要深入的研究；去甲基化試劑是否能成為靶向治療腎纖維化的有效策略也需要更多的臨床試驗(yàn)去驗(yàn)證。目前，我們課題組已經(jīng)在進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物模型靶向基因甲基化的治療實(shí)驗(yàn)，也取得了一定的結(jié)果，但是具體的作用機(jī)制還在探索當(dāng)中。明確表觀遺傳修飾在腎纖維化發(fā)生中的具體作用機(jī)制，有助于為腎纖維化的預(yù)防、干預(yù)和治療提供新的靶點(diǎn)和方向，同時(shí)為腎纖維化的臨床治療研究提供新的思路。