徐瑞濤，陳浩宇，陳美榕，張夢薇，張健

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457）

黑曲霉（Aspergillus niger）對人類活動既有有利的影響，也有不利影響。一方面它是公認(rèn)的安全發(fā)酵菌株，被廣泛應(yīng)用于檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)，同時它也是30多種酶制劑制備及重要蛋白的異源表達(dá)[1]。但是另一方面，它作為一種植物和人類病原體出現(xiàn)，前者與各種植物疾病有關(guān)，會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，后者與人類曲霉菌病等一些過敏性問題有關(guān)[2]。此外，近年來還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了可以產(chǎn)生赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、伏馬毒素B2和黃曲霉毒素的黑曲霉[3-4]，其安全性非常令人擔(dān)憂。因此迫切需要制定有效的防治措施，以限制黑曲霉侵染與毒素合成，減少經(jīng)濟(jì)損失，保護(hù)人和動物的健康。

黑曲霉通常以無性生殖的方式進(jìn)行繁殖，目前尚未發(fā)現(xiàn)其有性生殖方式[5-6]。黑曲霉的侵染過程如下：分生孢子附著到宿主表面并產(chǎn)生附著胞，附著胞生長到宿主細(xì)胞中形成胚芽管，胚芽管通過有絲分裂來分化、生長和發(fā)育以產(chǎn)生菌絲體。在黑曲霉的侵染過程中，宿主會采取各種防御策略來保護(hù)自身免受其侵染，比如：在受攻擊部位迅速積累活性氧（reaetive oxygen speeies，ROS）。這會導(dǎo)致宿主細(xì)胞局部死亡，從而阻止黑曲霉的進(jìn)一步擴散[7]。為了減少宿主產(chǎn)生的ROS的不利影響，黑曲霉已經(jīng)進(jìn)化出ROS清除系統(tǒng)，以去除過量的ROS，幫助自身存活。因此，黑曲霉的侵染過程是其與宿主斗爭的結(jié)果，而分生孢子是其侵染的工具。

黑曲霉可以產(chǎn)生多種真菌毒素，其中OTA是國際癌癥研究機構(gòu)認(rèn)定的“2B”類致癌物，嚴(yán)重影響人類健康[8]。自O(shè)TA發(fā)現(xiàn)以來，已有大量研究致力于解析其生物合成途徑和分子調(diào)控機制。然而，時至今日OTA的生物合成途徑和調(diào)控機制還遠(yuǎn)未闡明，尚未發(fā)現(xiàn)OTA合成基因簇內(nèi)的特異性調(diào)控因子[9]，因此我們無法針對特異性調(diào)控因子對OTA合成進(jìn)行調(diào)控。盡管如此，位于基因簇外還有一些全局調(diào)控因子，可調(diào)控多種次級代謝產(chǎn)物的合成，并且影響真菌的生長發(fā)育[10]。深入研究全局調(diào)控因子對黑曲霉侵染和OTA合成的影響，有可能建立以這些全局調(diào)控因子為靶標(biāo)的，能有效的限制黑曲霉侵染和OTA合成的控制策略。

研究者于2004年首次在構(gòu)巢曲霉發(fā)現(xiàn)了全局性調(diào)控因子LaeA[11]，隨后在黃曲霉、里氏木霉、產(chǎn)黃青霉、輪狀鐮刀霉菌等絲狀真菌中相繼發(fā)現(xiàn)了LaeA同源蛋白。大量研究表明LaeA可調(diào)控多種次級代謝基因簇的表達(dá)和次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，影響絲狀真菌的形態(tài)分化，它的發(fā)現(xiàn)對絲狀真菌的生長發(fā)育[12]和次級代謝產(chǎn)物[13-14]的研究具有極其重要的意義。在黑曲霉中，Niu等已經(jīng)證實LaeA對合成檸檬酸至關(guān)重要[15]，同時代謝譜研究表明LaeA可影響黑曲霉多種次級代謝產(chǎn)物的合成。目前，鮮見LaeA對黑曲霉侵染和OTA合成影響的報道。

本研究以產(chǎn)OTA黑曲霉A14作為出發(fā)菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的同源重組方法，構(gòu)建黑曲霉laeA基因敲除菌株，比較野生株和敲除菌株在形態(tài)發(fā)展、OTA合成和氧化耐受性的差異。揭示黑曲霉laeA基因在黑曲霉侵染和OTA合成中的作用，為有效地控制黑曲霉污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

野生型（wild type，WT）OTA產(chǎn)生菌株黑曲霉A14、E.coli DH5α、Agrobacterium tumefaciens AGL1、 質(zhì) 粒p44[16]、pMD18-T均由天津科技大學(xué)生化過程與技術(shù)實驗室保存。laeA基因缺失黑曲霉菌株ΔlaeA、質(zhì)粒p44-laeA為本研究構(gòu)建。

1.1.2 試劑

TaqDNA聚合酶（5U/μL）、T4DNA連接酶（10U/μL）、DL5000 DNA Maker、DL10 000 DNA Maker，限制性內(nèi)切酶 EcoRI（15 U/μL）、PstI（15 U/μL）、KpnI（15 U/μL）、Hind III（10 U/μL）：TaKaRa 公司；潮霉素 B、乙酰丁香酮、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒：Solarbio公司；其他生物化學(xué)類試劑：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

1.1.3 儀器與設(shè)備

OLYMPUS 719068光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA2004N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DELTA320 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL臺式高速離心機：上海醫(yī)藥分析儀器廠；HDL超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；NEXUS-GSX1 PCR擴增儀：德國eppendorf公司；HZQ-QX恒溫振蕩器：中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.1.4 引物

所使用的引物如表1所示。

表1 引物Table 1 Primers

1.1.5 培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基（lysogeny broth，LB）用于培養(yǎng)大腸桿菌和農(nóng)桿菌，完全培養(yǎng)基（complete medium，CM）和查氏培養(yǎng)基（czapek yeast exatract，CYA）用于培養(yǎng)黑曲霉，配制方法均參照文獻(xiàn)[17]。誘導(dǎo)培養(yǎng)基（induction medium，IM），農(nóng)桿菌侵染所需培養(yǎng)基及試劑參照文獻(xiàn)[18]配制。

1.2 laeA基因的擴增

參考美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）公布的黑曲霉CBS513.88中 laeA的基因序列 （Accession：XP-001389674.2），使用引物 laeA-f/laeA-r，以提取的黑曲霉A14基因組為模板，進(jìn)行PCR擴增以獲得laeA基因。PCR程序如下：95℃5min；95℃30 s，60℃30 s，72℃10 min，30個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物使用1%凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果送至華大基因進(jìn)行測序比對。并進(jìn)行蛋白分子量及等電點的預(yù)測。

1.3 敲除菌株ΔlaeA的構(gòu)建

以黑曲霉A14基因組為模板，利用引物laeAz-f/laeAz-r及l(fā)aeAy-f/laeAy-r分別擴增laeA基因的同源左右臂，并將其命名為laeA-H1和laeA-H2；分別將純化后所得laeA-H1和laeA-H2通過酶切連接的方法連接至載體p44上，由于laeA-H1中含有PstI酶切位點，所以先使用PstI和HindIII雙酶切將laeA-H2連接到質(zhì)粒p44中，同樣的方法，使用KpnI和EcoRI將laeA-H1片段雙酶切連接到過程質(zhì)粒p44-laeA-H2中，從而完成敲除質(zhì)粒p44-laeA的構(gòu)建（見圖1）。將構(gòu)建好的質(zhì)粒p44-laeA通過電轉(zhuǎn)化的方法，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AGL1中，將農(nóng)桿菌與黑曲霉A14共培養(yǎng)，篩選黑曲霉轉(zhuǎn)化子，具體參見曹張磊等的方法進(jìn)行[19]。提取轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗證，對驗證正確的轉(zhuǎn)化子，送至上海派森諾公司進(jìn)行重測序，以驗證潮霉素B抗性基因是否為單拷貝插入。

圖1 p44-laeA質(zhì)粒圖譜Fig.1 Vector map of p44-laeA

1.4 黑曲霉WT和ΔlaeA菌株形態(tài)觀測

挑取黑曲霉WT及ΔlaeA單菌落于平板中央，分別置于光照和黑暗的條件下25℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)并測菌落直徑。采用直徑20 mm的打孔器從菌落中心打孔采樣，將孢子用1 mL無菌水洗下，血球計數(shù)板計數(shù)，進(jìn)行產(chǎn)孢量分析。將孢懸稀釋到105個/mL，分別吸取孢懸液5 μL至載玻片與培養(yǎng)基接觸的縫隙中，25℃培養(yǎng)24 h，將載玻片取出置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲狀態(tài)；取 2 μL 分別于含 0、5、10 mmol/L H2O2的CYA固體培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長情況；分別取50 μL于50 mL CYA液體培養(yǎng)基中，25℃于黑暗和光照條件下培養(yǎng)7 d，考察液體培養(yǎng)的生物量變化。

1.5 黑曲霉WT和ΔlaeA產(chǎn)赭曲霉毒素的測定

分別取100μL105個/mL的孢子懸液接種于100mL CYA培養(yǎng)基中，分別置于光照與黑暗條件下25℃培養(yǎng)7 d，取適量3 d～7 d CYA培養(yǎng)液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾并使用高效液相色譜熒光檢測器（high performance liquidchromatography-fluorescencedetector，HPLC-FLD）進(jìn)行次級代謝譜檢測。檢測條件為：采用KromstarTM C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；激發(fā)波長：333 nm，發(fā)射波長：460 nm；流動相為乙腈∶水∶醋酸=99∶99 ∶2（體積比）；流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL。

1.6 氧化脅迫對黑曲霉WT及ΔlaeA突變株胞內(nèi)抗氧化酶活性影響

測定5 mmol/L H2O2脅迫下黑曲霉WT及ΔlaeA菌株胞內(nèi)過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）以及谷胱甘肽過氧化物酶（glutlthione perolidlse，GPX）酶活，具體參見陳浩宇等的方法進(jìn)行[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 laeA基因的克隆及分析

以提取的黑曲霉WT基因組為模板，laeA-F/laeAR為引物，擴增laeA同源基因，電泳后條帶大小符合預(yù)期1 763 bp。將其連接到pMD18-T載體上，送至華大測序。將測序結(jié)果與NCBI上黑曲霉CBS513.88已公布的laeA基因進(jìn)行比對，結(jié)果是二者序列完全相同，因此黑曲霉A14中含有與CBS513.88中完全相同的laeA基因，該基因全長1 763 bp，含有1個內(nèi)含子（144 bp），編碼375個氨基酸。預(yù)測的LaeA蛋白的分子量為43 361.48，等電點為5.76。

2.2 laeA基因敲除菌株的構(gòu)建

將所得質(zhì)粒p44-laeA經(jīng)E.coliDH5α和AGL1轉(zhuǎn)入黑曲霉WT中，通過p44-laeA載體所帶的hyg（潮霉素B抗性基因）對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，獲得敲除laeA基因的抗性菌株。敲除菌株同源重組構(gòu)建及驗證如圖2所示。

圖2 laeA基因同源重組敲除及電泳驗證圖Fig.2 laeA gene disruption by homologous recombinant and electrophoretic validation

使用引物laeAz-f/laeAy-r進(jìn)行PCR驗證。圖2B中1號泳道以p44-laeA質(zhì)粒為模版為陽性對照，14號泳道以WT菌株基因組為模版為陰性對照，3號～9號、11號～13號泳道同源重組片段隨機插入出現(xiàn)兩條條帶，2和10號泳道轉(zhuǎn)化子擴增出3151bp單一條帶，沒有原始基因組的2 736 bp（859 bp+981 bp+896 bp）的條帶，說明這兩個轉(zhuǎn)化子的laeA基因目標(biāo)敲除片段的981 bp已經(jīng)被1 396 bp的潮霉素抗性片段同源重組雙交換所替代，從而破壞laeA基因，為正確的同源重組雙交換敲除菌株。將得到的敲除株進(jìn)行重測序進(jìn)一步驗證，得到hyg的插入方式為反向插入，拷貝數(shù)為1。

2.3 黑曲霉WT及l(fā)aeA基因缺失菌株表型分析

黑曲霉WT及ΔlaeA菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢情況及菌體干重如圖3所示。

比較黑曲霉WT與ΔlaeA菌株菌落形態(tài)（圖3A），發(fā)現(xiàn)兩菌株整體呈棕色，菌落中間有大量棕色孢子，邊緣菌絲呈乳黃色，ΔlaeA與WT菌株相比，菌落中間呈現(xiàn)出更多褶皺，有更多凸起，而WT菌株較為平整，黑暗條件下菌株顏色整體較深。ΔlaeA菌株菌絲疏松，枝節(jié)較長且直，WT菌株菌絲稠密，枝節(jié)較多且短，光照對菌絲生長無顯著影響。ΔlaeA與WT菌株相比，光照條件下菌落直徑減少3.87%，黑暗條件下，直徑減少11.76%（圖3B）。孢子計數(shù)表明，光照條件下ΔlaeA與WT菌株相比產(chǎn)孢量減少22.81%，黑暗條件下，ΔlaeA與WT菌株相比產(chǎn)孢量減少 23.49%（圖3C）。液體培養(yǎng)測量菌體生物量發(fā)現(xiàn)，光照條件下ΔlaeA與WT菌株相比菌體干重減少18.49%，黑暗條件下，ΔlaeA與WT菌株相比菌體干重減少20.97%（圖3D）。

圖3 黑曲霉WT及ΔlaeA菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢情況及菌體干重Fig.3 Role of laeA in A.niger colony，hyphal，conidiation and biomass

2.4 黑曲霉WT及ΔlaeA菌株產(chǎn)毒分析

典型的黑曲霉WT及ΔlaeA菌株的HPLC檢測結(jié)果如圖4所示（黑暗條件培養(yǎng)4 d），WT菌株可檢測到明顯的赭曲霉毒素 β（OTβ）、赭曲霉毒素 α（OTα）以及OTA的峰，出峰時間分別為4.122、5.869 min和8.911 min；ΔlaeA 菌株中，OTβ，OTα 以及 OTA 的峰面積顯著減少。OTA生物合成見圖5。黑曲霉WT菌株在黑暗和光照條件下培養(yǎng)3 d～7 d，OTA含量均持續(xù)增加，但黑暗條件更有利于OTA的合成；ΔlaeA菌株在黑暗和光照條件下培養(yǎng)3 d～7 d，OTA含量極低且?guī)缀鯚o變化，培養(yǎng)7 d，相比WT菌株OTA含量分別減少92.45%（光照）和99.03%（黑暗）。

圖4 黑曲霉WT及ΔlaeA菌株OTβ，OTα以及OTA的HPLC-FLD檢測結(jié)果Fig.4 The HPLC-FLD detection results of OTβ，OTα and OTA of A.niger WT and ΔlaeA strains

圖5 黑曲霉WT及ΔlaeA菌株生長3d～7d過程中OTA生物合成Fig.5 OTA biosynthesis of A.niger WT and ΔlaeA strains during 3 d-7 d culture

2.5 黑曲霉WT及ΔlaeA菌株的H2O2耐受性分析

H2O2對WT及ΔlaeA菌株生長影響見圖6。氧化脅迫的產(chǎn)生是由于胞內(nèi)活性氧含量過高，使得胞內(nèi)氧化還原的狀態(tài)失衡，進(jìn)而引起菌體一系列應(yīng)激反應(yīng)，菌體通過激活相關(guān)基因的表達(dá)來降解活性氧從而修復(fù)和維持細(xì)胞的動態(tài)平衡。為探究laeA基因?qū)谇寡趸褪艿挠绊?，分別測定不同濃度H2O2脅迫下，黑曲霉WT及ΔlaeA菌株的生長情況。如圖6所示，隨著H2O2濃度的增加，黑曲霉WT和ΔlaeA菌株的生長均受到抑制，但ΔlaeA菌株對H2O2更為敏感，10 mmol/L的H2O2即可完全抑制其生長。

圖6 H2O2對WT及ΔlaeA菌株生長影響Fig.6 The effect of the H2O2on the growth of WT and ΔlaeA strains

2.6 H2O2脅迫對菌株胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響

為探究黑曲霉WT和ΔlaeA菌株的對H2O2的不同耐受性，分別測定了3種抗氧化酶活性，結(jié)果如圖7，可見ΔlaeA胞內(nèi)CAT、SOD及GXP酶的活性在脅迫生長前期明顯低于WT菌株，且均在生長第3天最為顯著，與WT菌株相比，ΔlaeA菌株胞內(nèi)CAT活性降低2.17倍，SOD活性降低1.55倍，GPX活性降低1.44倍。

圖7 外源H2O2的添加對黑曲霉WT及ΔlaeA菌株抗氧化酶活的影響Fig.7 The effect of exogenous H2O2on antioxidant enzyme activity of A.niger WT and ΔlaeA strains

3 結(jié)論

以黑曲霉A14作為出發(fā)菌株，全局調(diào)控因子laeA基因為研究對象，通過分子改造構(gòu)建了敲除菌株ΔlaeA，探究該基因?qū)谇剐螒B(tài)發(fā)展，赭曲霉毒素合成和氧化耐受的影響。結(jié)果顯示，ΔlaeA菌株菌落生長直徑及產(chǎn)孢量與WT菌株相比均有不同程度的減少，菌絲較長且松散，可見該基因正向調(diào)控黑曲霉產(chǎn)孢。Kosalková等將黃青霉菌株laeA基因敲除后亦發(fā)現(xiàn)孢子產(chǎn)量減少[21]，與本研究相似，而孢子減少意味著侵染的媒介減少，可見敲除該基因可抑制黑曲霉侵染。

Crespo-Sempere等曾敲除炭黑曲霉中l(wèi)aeA基因[22]，并與野生菌株分別在光照及黑暗條件下生長4 d比較OTA合成量，laeA基因缺失光照條件下減少68.5%，黑暗條件下減少97%，與本研究中結(jié)果相似，ΔlaeA菌株產(chǎn)赭曲霉毒素?zé)o論在光照還是黑暗條件下與WT菌株相比均顯著減少，本研究首次敲除并證明laeA基因正向調(diào)控黑曲霉OTA的產(chǎn)生，為建立以全局調(diào)控因子LaeA為靶標(biāo)的有效限制黑曲霉OTA合成控制提供理論依據(jù)。

Wu等的研究表明veA及l(fā)aeA的缺失會導(dǎo)致異旋孢腔菌菌株對H2O2的耐受性減弱[23]，本研究發(fā)現(xiàn)laeA的缺失會導(dǎo)致黑曲霉菌株對H2O2的耐受性減弱，抗氧化酶活性減弱因為LaeA的缺失使其對抗氧化酶的正常調(diào)節(jié)產(chǎn)生紊亂，菌體不能對抗氧化酶起到正常調(diào)節(jié)，致使黑曲霉胞內(nèi)抗氧化酶活性低于氧化脅迫時正?；钚运?，這說明LaeA蛋白正調(diào)控黑曲霉氧化耐受性。但研究只用了H2O2制造氧化脅迫環(huán)境，沒有排除試劑本身對氧化敏感性的影響。氧化敏感增強意味著其毒力減弱，當(dāng)侵染植物宿主時，宿主產(chǎn)生的ROS會更容易抑制敲除株的生長，再一次證明敲除laeA基因不但抑制OTA合成，而且抑制黑曲霉侵染。本研究為探究OTA生物合成過程中的調(diào)控機制及制定有效的防治措施限制黑曲霉侵染和OTA合成提供了理論依據(jù)。