鹿士峰，田淑雨，吳楊洋，杜秀菊

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城252059）

香菇（Lentinus edodes）是一種食藥兩用真菌[1]。香菇富有營(yíng)養(yǎng)，香味濃郁，具有藥用及滋補(bǔ)養(yǎng)生作用，被人們稱為“抗癌新兵”、“蘑菇皇后”、“菌種之秀”[2]。研究表明，作為重要的生物活性成分，香菇多糖具有抗輻射[3]、降血糖[4]、抗菌抗病毒[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]等多種藥理活性。

提取多糖的方法有多種，熱水浸提法為應(yīng)用最廣泛。隨著應(yīng)用技術(shù)的提高，微波輔助法、超聲波輔助法、酶法等提取方法也應(yīng)用到香菇多糖提取中。如魏楨元等[8]采用響應(yīng)面優(yōu)化法提取香菇多糖，得率為14.22%。吳佳慧等[9]利用混合酶技術(shù)提多糖，提取率達(dá)到了37.07%。王俊穎等[10]通過微波輔助法提取多糖，多糖提取率為8.72%?？梢姴煌崛》椒〞?huì)對(duì)香菇多糖的提取產(chǎn)生影響。目前文獻(xiàn)中缺少全面綜合的對(duì)多種方法提取香菇多糖含量、單糖組成及抗氧化活性的比較。因此本試驗(yàn)采用熱水法、酶法、超聲輔助法和微波輔助法提取香菇粗多糖，探討了不同方法提取所得香菇多糖的差異，希望為高效開發(fā)利用香菇多糖提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇子實(shí)體：市售；纖維素酶（酶活為3 U/mg）：美國(guó)Solarbio公司；標(biāo)準(zhǔn)單糖鼠李糖（L-Rha）、D-葡萄糖（D-Glc）、L-阿拉伯糖（L-Ara）、果糖（D-Fru）、D-甘露糖（D-Man）、D-半乳糖（D-Gal）、D-木糖（D-Xyl）、D-氨基葡萄糖（D-Glu）、D-巖藻糖（D-Fuc）、D-葡萄糖醛酸（D-GlcA）、D-半乳糖醛酸（D-GalA）：美國(guó) Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WF-J2100型可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；KQ-100VDV型雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Sorvall Stratos離心機(jī)：德國(guó)Thermo Fisher；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；JY92-IIN超聲波破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司；WP700TL23-K5格蘭仕微波爐：佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司；FT/IR Scimitor 800：Varian，USA。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

香菇子實(shí)體烘干，粉碎，過80目篩，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入90%乙醇浸提過夜，浸提2次，（2 700×g）離心15 min，殘?jiān)匀伙L(fēng)干后備用。

1.3.2 香菇多糖的不同方式提取

1.3.2.1 熱水浸提法

按照曾智平[11]的最優(yōu)條件進(jìn)行提取，并略作改動(dòng)。取 1 g香菇粉（預(yù)處理后），按 1∶30（g/mL）的比例加入蒸餾水，90 ℃水浴，浸提 3 h，離心（2700×g）15 min，得多糖提取液。提取液濃縮過濾，加入4倍體積95%酒精，快速攪拌，4℃冰箱內(nèi)冷藏過夜，離心干燥后得熱水浸提香菇多糖（hot water extraction polysaccharide of Lentinus edodes，H-LEP）。平行試驗(yàn)3次，取平均值。

1.3.2.2 超聲輔助提取法

按照孫亞杰等[12]的最優(yōu)條件進(jìn)行提取。取預(yù)處理干燥后香菇粉1 g，按1∶30（g/mL）比例加入蒸餾水，超聲功率為580 W，超聲溫度64℃，提取1 h，提取液離心（2 700×g）15 min。之后按1.3.2.1中所述方法操作，所得超聲提取香菇多糖（ultrasonic extraction polysaccharide of Lentinus edodes，U-LEP）。

1.3.2.3 酶提輔助提取法

按照李波等[13]的最優(yōu)條件進(jìn)行提取，并略作改動(dòng)。取預(yù)處理干燥后香菇粉1 g，按1∶25（g/mL）比例加蒸餾水，纖維素酶濃度為0.25%，調(diào)節(jié)pH值至5.0，40℃提取1 h后升溫到90℃滅酶活10min，提取液離心（2 700×g）15 min。之后按1.3.2.1中方法處理，所得酶提香菇多糖（enzyme extraction polysaccharide of Lentinus edodes，E-LEP）。

1.3.2.4 微波輔助提取法

按照劉小麗等[14]的最優(yōu)條件進(jìn)行提取，并略作改動(dòng)。取預(yù)處理干燥后香菇粉1 g，按1∶20（g/mL）料液比加入蒸餾水，微波功率280 W，時(shí)間5 min，提取液離心（2 700×g）15 min。之后按 1.3.2.1 中方法處理，所得微波提取香菇多糖（microwave extraction polysaccharide of Lentinus edodes，M-LEP）。

1.3.3 多糖和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

總糖含量檢測(cè)采用苯酚-硫酸法[15]，還原糖含量的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸比色法（3，5-dinitosalicylic acid，DNS法）法[16]，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[17]。多糖含量計(jì)算公式如下：

1.3.4 紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析

分別取2 mg的4種多糖樣品進(jìn)行紅外光譜分析（KBr壓片），F(xiàn)T-IR掃描測(cè)定范圍為4 000 cm-1～400 cm-1[18]。

1.3.5 單糖組分分析

以 D-Glc，D-Gal，D-Man，L-Fuc，D-Xyl，D-GlcA，L-Rha，D-Glu，D-Fru，D-Ara，和 D-GalA 作為單糖標(biāo)準(zhǔn)，用高效陰離子交換色譜（high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）分析單糖組分。簡(jiǎn)述如下：取樣品2 mg于三角瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）10 mL，110℃下靜置 5 h后加入 3 mL甲醇真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，干燥至恒重。加入蒸餾水定容到100mL，離子色譜儀進(jìn)行單糖組分檢測(cè)。洗脫條件為：洗脫液為濃度1 mol/L的NaAc和0.25 mol/L的NaOH的混合液，洗脫液流速為0.45 mL/min[19-20]。

1.3.6 抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.6.1 多糖樣品液的配制

稱取樣品（E-LEP、H-LEP、U-LEP 和 M-LEP）溶解配制成 62.5、125、250、500、1 000、1 500、2 000 μg/mL備用。分別以蒸餾水和抗壞血酸（Vc）作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6.2 總還原力的測(cè)定

按順序往試管中依次加入1 mL多糖樣品液、2 mL 0.2 mol/LpH值為6.6的磷酸緩沖鹽溶液和2 mL的1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃水浴中反應(yīng)20 min，迅速冷卻后加入10%三氯乙酸溶液2 mL，離心（2 700×g，10 min），取上清液2.5 mL，加1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液和2.5 mL超純水，混勻，靜置10 min。在700 nm處測(cè)吸光值[21]。

1.3.6.3 DPPH自由基清除力的測(cè)定

1 mL樣品液和1 mL 0.2 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液混合均勻，避光靜置30 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值（Ai）；1 mL無(wú)水乙醇溶液與1 mL樣品混勻，靜置30 min，測(cè)吸光度值（Aj）；1 mL的無(wú)水乙醇溶液與1 mL 0.2 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液混勻，靜置30 min，測(cè)吸光度值（Ao）[22]。

DPPH自由基清除率（I）的計(jì)算公式為：

1.3.6.4 羥自由基清除能力的測(cè)定

依次加入4mmol/LFeSO4溶液1mL，1mL4mmol/L 30%H2O2溶液，1 mL超純水和1 mL 4 mmol/L水楊酸乙醇溶液混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，離心（2 700×g）10 min，510 nm 處測(cè)溶液的吸光度值為 A0。取1 mL 4 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 4 mmol/L 30%H2O2溶液，1 mL樣品液和1 mL 4 mmol/L水楊酸乙醇溶液混合均勻，按上述方法處理測(cè)得吸光度值為Ai。取1 mL 4 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 4 mmol/L 30%H2O2溶液，1 mL樣品液和1 mL乙醇溶液混合均勻，按上述方法處理測(cè)得吸光度值為Aj[23]。

羥自由基清除率（I）計(jì)算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取的香菇多糖得率及糖含量的比較

蛋白質(zhì)含量及多糖含量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，4種方法提取蛋白質(zhì)及多糖含量及粗多糖含量見表1。

表1 M-LEP、H-LEP、E-LEP、U-LEP的得率及糖含量比較Table 1 Yield and sugar content of M-LEP,H-LEP,E-LEP and U-LEP

圖1 總糖、還原糖及蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The standard curve of total sugar，reduce sugar and protein

熱水浸提法的多糖提取率、總糖含量及多糖含量分別為4.76%、20.22%、18.13%。微波輔助提取法的多糖提取率、總糖含量及多糖含量最高，分別為9.48%、44.79、43.17%，而酶提輔助法的多糖提取率雖有所提高，為7.43%，但總糖含量及多糖含量與普通水提法相比有所降低，分別為15.37%、13.28%，較普通水提沒有明顯的提取優(yōu)勢(shì)。

2.2 FT-IR分析

FT-IR分析結(jié)果見圖2。

圖2 FT-IR分析結(jié)果Fig.2 The analysis results of FT-IR

通過傅里葉紅外光譜分析儀鑒定4種多糖（MLEP、H-LEP、E-LEP、U-LEP）的結(jié)構(gòu)特征，F(xiàn)T-IR 的4個(gè)紅外光譜圖峰形與峰位置相似，但峰強(qiáng)度有差異，說明4種方法提取物結(jié)構(gòu)類型相似，但含量有差異。3 500 cm-1～3 200 cm-1處存在較強(qiáng)吸收峰，是由OH 伸縮振動(dòng)引起。3 000 cm-1～2 800 cm-1和 1 400 cm-1～1 200 cm-1微弱吸收峰分別是由于C-H的伸縮和變角振動(dòng)[24]，1 650 cm-1附近為酰胺基C=O伸縮振動(dòng)[25]。上述波段處的吸收峰為糖類的特征吸收峰，表明4種樣品均為多糖。1 250 cm-1～950 cm-1之間的強(qiáng)峰，是吡喃糖環(huán)的醚鍵（C-O-C）[26]，可以推測(cè)4種多糖均為吡喃糖。

2.3 單糖組分分析

多糖的組成成分和摩爾比對(duì)生物活性有很重要的作用[27]。采用甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖等11種標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品作為參照，高效陰離子交換色譜鑒定單糖組分。分析結(jié)果見圖3。

圖311 種單糖的HPAEC-PAD光譜Fig.3 The spectra of HPAEC-PAD of 11 monosaccharides

通過對(duì)樣品色譜圖的保留時(shí)間與11種單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)4種不同提取方法得到的多糖其單糖組成比例各不相同。10種標(biāo)準(zhǔn)單糖的HPAEC-PAD圖譜分析結(jié)果如圖 3a，E-TAP、H-TAP、M-TAP 和 UTAP的單糖組分圖譜如圖3b～e。通過與單糖標(biāo)準(zhǔn)圖譜（圖3a）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)酶輔助提取法得到粗多糖其單糖組成最多，有7種不同單糖。而水提、微波、超聲所得粗多糖的單糖組成均為6種，熱水提取法、微波法得到粗多糖其水解后不含氨基葡萄糖，超聲法得到粗多糖其水解后不含木糖，可能是由于纖維素酶破壞了細(xì)胞壁組織，使多糖從細(xì)胞內(nèi)大量溶出，從而使單糖種類相對(duì)增加。不同提取方法所得香菇多糖的單糖組成見表2。

由表2可知，D-葡萄糖是4種多糖（E-LEP、H-LEP、U-LEP、M-LEP）的主要組成組分，其摩爾百分含量分別為50.09%、48.95%、55.83%、49.92%。而U-LEP的D-葡萄糖醛酸含量明顯高于其他3種多糖，為10.09%。

表2 不同提取方法所得香菇多糖的單糖組成Table 2 Monsaccharide components of various polysaccharides from Lentinus edodes

2.4 抗氧化活性

自由基極不穩(wěn)定，會(huì)從鄰近人體細(xì)胞內(nèi)奪取電子，這種氧化現(xiàn)象會(huì)使細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞。而羥自由基會(huì)使賴氨酸迅速損傷[28]，引起許多疾病，多糖的抗氧化作用通常用羥自由基清除能力來(lái)評(píng)估[29]。清除自由基能力反映著抗氧化水平的高低，而多糖有較強(qiáng)的清除自由基能力，所以從不同的提取方法中選取較強(qiáng)清除力的多糖就顯得尤其重要。分別對(duì)4種多糖進(jìn)行抗氧化活性鑒定，見圖4。

圖4 4種提取方式所得香菇多糖抗氧化活性Fig.4 The antioxidant properties of Lentinus edodes polysaccharide in four different extraction methods

由圖4所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，其DPPH自由基清除力、羥自由基清除力、總還原力均呈濃度梯度依賴性，隨著濃度梯度的增加，其抗氧化活性逐漸增強(qiáng)。4種提取方式提取香菇多糖抗氧化活性的EC50值見表3。

表3 4種提取方式提取香菇多糖抗氧化活性的EC50值Table 3 EC50values of antioxidant properties from Lentinus edodes polysaccharide in four different extraction methods

EC50值表3表明，H-LEP的DPPH自由基清除力最高，M-LEP的羥自由基清除力最高，總還原力近似相同。DPPH自由基清除力大小由強(qiáng)至弱排列順序?yàn)椋篐-LEP＞E-LEP＞U-LEP＞M-LEP，羥自由基清除力大小由強(qiáng)至弱排列順序?yàn)椋篗-LEP＞H-LEP＞U-LEP＞ELEP，總還原力由強(qiáng)至弱排列順序?yàn)椋篐-LEP＞U-LEP＞E-LEP＞M-LEP。

3 討論

本試驗(yàn)通過熱水浸提法、超聲輔助提取法、酶提輔助法、微波輔助提取法4種方法提取香菇多糖，并對(duì)其糖含量、蛋白含量、單糖組成及其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取法、酶提輔助法、微波輔助法的多糖提取得率及多糖含量較熱水浸提法有所升高。通過HPAEC-PAD和FT-IR的方法鑒定4種多糖的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)4種多糖的單糖組成大體相似，但摩爾比例明顯不同。試驗(yàn)結(jié)果表明，微波輔助提取法的粗多糖提取率及糖含量最高，分別為9.48%、43.17%。熱水浸提法粗多糖提取率及糖含量?jī)H為4.76%、18.13%，較熱水浸提法而言，糖含量顯著提高。且微波輔助法所提多糖有較強(qiáng)的清除羥自由基能力，其活性接近于陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸。綜合考慮4種不同提取方法所得多糖的提取得率、多糖含量及抗氧化作用，在熱水浸提、超聲輔助提取、酶輔助提取和微波輔助提取4種提取方法中，微波輔助為香菇多糖最優(yōu)提取方法。