徐明遠 王謙博 郭盛磊,4 王瑩威 李鳳霞 劉 佳 唐中華 王振月*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040； 2.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510000； 3.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040； 4.黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司博士后科研工作站，哈爾濱 150040)

刺五加(Acanthopanaxsenticosus(Rupr.Maxim.) Harms)為五加科(Araliaceae)五加屬(Acanthopanax)多年生落葉無性系灌木，主要分布于中國東北部、朝鮮、日本、俄羅斯及西伯利亞一帶，又名西伯利亞參、五加參、刺拐棒、一百針、老虎潦等?！吨腥A人民共和國藥典》(2015版)規(guī)定其干燥根及根莖或莖可入藥，具有健脾、安神、補腎、祛風(fēng)濕等功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)實驗證明刺五加具有保護神經(jīng)元和心腦血管、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、降血糖及免疫調(diào)節(jié)作用等多種功效[2]。刺五加自然更新周期約十年以上，隨著刺五加片、刺五加飲料等以刺五加為原料的產(chǎn)品遠銷國內(nèi)外，其天然資源面臨瀕危、枯竭，1992年《中國植物紅皮書》中將其列為漸危物種，需大力發(fā)展人工栽培。

近年來，藥用植物生長年限對其次生代謝產(chǎn)物的影響備受學(xué)者重視。李心怡、殷少文等對不同培育年限對川桔梗、青錢柳等藥用植物活性成分影響研究結(jié)果表明，藥用植物在不同生長年限次生代謝產(chǎn)物含量變化差異較大[3～4]。為此，可根據(jù)臨床用藥和中藥制劑需求有選擇性地確定采收年限，對中藥材合理開發(fā)利用具有重要的意義。

刺五加中含有豐富的化學(xué)成分，主要包括黃酮類、簡單苯丙素類、有機酸類、香豆素類、三萜皂苷類、氨基酸類以及其他類化合物[2]。目前，對于刺五加活性成分的研究主要集中在苯丙素類成分，包括紫丁香苷、異嗪皮啶以及刺五加苷E[5～7]，它們是刺五加抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。其中，紫丁香苷是中國藥典中規(guī)定的質(zhì)控指標(biāo)成分[1]。刺五加中也具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、清除自由基等多方面的藥理作用的黃酮類化合物，包括槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷[9～10]。目前，對于不同培育年限對刺五加次生代謝產(chǎn)物影響的報道不多，王振月、張萍等對不同生長年限刺五加中異嗪皮啶含量，王振月等對不同生長年限刺五加中總黃酮含量進行了研究，研究結(jié)果表明，不同生長年限刺五加中異嗪皮啶、總黃酮含量顯示出顯著的差異[11～12]。由于還沒有關(guān)于對苯丙素、黃酮類次生代謝產(chǎn)物的綜合研究，故單一成分不能全面反映年限對于刺五加次生代謝產(chǎn)物積累的影響。

因此，本研究收集同一產(chǎn)地不同生長階段刺五加，觀察根部及莖部主要藥用次生代謝物含量變化，以期揭示不同培育年限對刺五加苷E、槲皮苷、蘆丁、異嗪皮啶、紫丁香苷、金絲桃苷6種主要藥用活性成分的影響，對確定人工栽培刺五加采收年限及實際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

API3000高效液相—質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧電離源(ESI)及Analyst1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))美國AB公司；FZ-06中藥粉碎機浙江溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠；250DC型數(shù)控超聲波清洗器江蘇昆山超聲儀器有限公司；BS124S電子天平德國Sartorius公司；Millipore超純水儀法國Millipore公司。

三年生、五年生、九年生種植刺五加根、莖采于黑龍江省七臺河市，實驗前用粉碎機粉碎，粉末過20目篩備用；刺五加苷E、槲皮苷、蘆丁、異嗪皮啶、紫丁香苷、金絲桃苷(純度均≥98%)標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品生物制品檢定所；色譜甲醇、乙腈購于北京百靈威公司；色譜甲酸購于美國Sigma公司；去離子水用超純水儀自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試樣品溶液的制備

取刺五加粉末0.5 g，加入甲醇20 mL超聲提取(100 kHz，40℃)30 min，過濾后將殘渣再加入20 mL溶劑超聲提取30 min，過濾后合并兩次濾液，測定前用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備

分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品用色譜甲醇溶解、定容，配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用前根?jù)需要用流動相配成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 色譜條件

采用超高效液相色譜系統(tǒng)(Ultra-Performance LC，Waters，Japan)；Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25℃；進樣量為10 μL；流動相為水和甲醇，流速保持在0.5 mL·min-1。梯度洗脫程序為：最初0～1.5 min 25%甲醇，1.5～2 min 25%～50%甲醇，2～4 min 50%甲醇，4～4.5 min 50%～90%甲醇，4.5～5.5 min 90%甲醇，5.5～6 min 90%～25%甲醇，6～7 min 25%甲醇。

1.2.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(Electrospray ionization，ESI)，負離子掃描、多離子反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitoring，MRM)掃描方式.優(yōu)化后最終的質(zhì)譜條件：電噴霧離子源噴霧電壓為5500V，離子源霧化溫度為500℃，霧化氣壓為25psi，氣簾氣壓為20psi。紫丁香苷：m/z394.8→231.8，去簇電壓70 V，碰撞電壓40 V，碰撞室射出電壓17 V；刺五加苷E：m/z765.3.0→603.1，去簇電壓70 V，碰撞電壓62 V，碰撞室射出電壓23 V;異嗪皮啶：m/z223.1→206.3，去簇電壓60 V，碰撞電壓40 V，碰撞室射出電壓9 V；蘆?。簃/z611.1→464.8，去簇電壓80 V，碰撞電壓20 V，碰撞室射出電壓13 V；槲皮苷：m/z449.2→303，去簇電壓50 V，碰撞電壓16 V，碰撞室射出電壓17 V；金絲桃苷：m/z487→324，去簇電壓70 V，碰撞電壓43 V，碰撞室射出電壓17 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗設(shè)置3個平行，數(shù)據(jù)測定均重復(fù)3次，利用SPSS 21.0(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)軟件進行主成分分析，計算主成分的綜合得分Q值，用Q值反映培育年限對刺五加主要6種活性成分的綜合影響。培育年限影響的差異采用SPSS單因素方差分析，并進行t檢驗，當(dāng)P<0.05時認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

Q值的計算公式如下：

F1=α11X1+α12X2+α13X3

(1)

F2=α22X1+α22X2+α23X3

(2)

Fp=αp1X1+αp2X2+αp3X3

(3)

Q=(λ1F1+λ2F2+…+λpFp)/(λ1+λ2+…+λp)

(4)

式中，F(xiàn)p(p=1,2,…,3)為主成分得分；αp1，αp2，…，αp3為主成分表達矩陣系數(shù)(Component score coefficient)，其被計算為主成分加載向量(在分量矩陣中)除以對應(yīng)特征值的平方根(在所解釋的總方差中)；X是通過標(biāo)準(zhǔn)化的原始變量的值；λ是初始特征值方差的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培育年限對刺五加6種活性成分的綜合影響

通過SPSS軟件進行主成分分析，用主成分綜合得分(Q值)說明不同培育年限刺五加根及莖中6種主要藥用次生代謝物含量變化(圖1)。6種次生代謝產(chǎn)物的累積在根和莖中均顯示出五年生最高，在根中，九年生的積累大于三年生，在莖中則顯示出三年生大于九年生。

圖1 不同培育年限對刺五加根、莖中次生代謝物累積的影響Fig.1 Effects of different growth years on the accumulation of secondary metabolites in roots and stems of A.senticosus

2.2 3種苯丙素類活性成分在不同培育年限的積累

由圖2，紫丁香苷的含量在刺五加根中隨年限增加而上升，九年生根的含量顯著大于其他年限(P<0.05)。紫丁香苷的含量在刺五加莖中隨年限增加顯示出先上升后下降，其含量在五年生莖中顯著大于其他年限(P<0.05)，三年生顯著大于九年生(P<0.05)。紫丁香苷在三年生刺五加根、莖中含量無顯著性差異，五年生莖中含量顯著高于五年生根，九年生根中含量顯著高于九年生莖。

圖2 不同生長階段苯丙素類成分在刺五加根及莖中的累積情況 A.根；B.莖Fig.2 Accumulation of phenylalanine in roots and stems of A.senticosus at different growth stages A.Root；B.Stem

圖3 不同生長階段黃酮類成分在刺五加根及莖中的累積情況 A.根；B.莖Fig.3 Accumulation of flavonoids in roots and stems of A.senticosus at different growth stages A.Root；B.Stem

刺五加苷E的含量在刺五加根中隨年限的增加，顯示出先上升后下降，五年生大于三年生和九年生(P<0.05)。刺五加苷E的含量在刺五加莖中隨年限增加而下降，三年生大于五年生和九年生(P<0.05)。不同年限根和莖的含量比較可以看出，三年生莖含量顯著高于三年生根，五年生和九年生根和莖中刺五加苷E含量無顯著性差異。

刺五加根和莖中異嗪皮啶含量的變化存在相同的趨勢，二者都在三年生含量最高，五年生含量最低。其中，在根中三年生和九年生含量無顯著性差異，均高于五年生。異嗪皮啶在三年生刺五加莖中含量顯著高于五年生和九年生(P<0.05)，九年生大于五年生，二者無顯著性差異。異嗪皮啶在不同部位中的累積結(jié)果顯示，三年生和九年生莖的含量顯著大于根，五年生根和莖含量無顯著性差異。

2.3 3種黃酮類活性成分在不同培育年限的積累

由圖3可知，刺五加根和莖中蘆丁的含量隨著年限的增加而顯示出先上升后下降的趨勢，其中五年生蘆丁含量顯著高于三年生和九年生(P<0.05)。五年生刺五加根中蘆丁含量大于三年生，五年生刺五加莖中蘆丁的含量大于九年生。在不同部位中的積累，三年生根和莖無顯著性差異，五年生莖顯著大于根，九年生根顯著大于九年生莖。各培育年限莖中蘆丁的含量均顯著高于根。

槲皮苷在刺五加根的含量隨著培育年限的增加而降低，三年生含量顯著高于五年生和九年生(P<0.05)。在刺五加莖中，槲皮苷含量隨著培育年限的增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，其含量在五年生莖中顯著高于三年生和九年生(P<0.05)，且九年生含量大于三年生。槲皮苷在三年生根和莖中含量無顯著性差異，五年生及九年生的莖中含量顯著高于根。

金絲桃苷的含量在刺五加根中隨培育年限增加顯示出先上升后下降，其含量在五年生根中顯著高于其他年限(P<0.05)，且九年生含量大于三年生。在刺五加莖中，金絲桃苷的含量隨培育年限升高而降低，三年生莖中含量顯著高于其他年限(P<0.05)。各培育年限莖中金絲桃苷的含量均顯著高于根。

3 討論

3.1 苯丙素類成分在不同培育年限的積累及其最佳采收年限

苯丙素類成分是刺五加中的主要活性成分，該類成分是刺五加的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。紫丁香苷是刺五加中的主要藥用成分之一，有保護心血管[2]、抗腫瘤[14]及保護腎臟[15]等功效。本研究結(jié)果顯示，紫丁香苷在五年生莖中累積含量最高，其次為九年生根，考慮到種植成本，獲得紫丁香苷的最佳采收年限為五年。刺五加苷E具有治療糖尿病[16]、鎮(zhèn)靜催眠[17]、促進學(xué)習(xí)和記憶[18]、抗炎性反應(yīng)[19]等藥理活性，是刺五加的重要藥用活性成分。本研究結(jié)果顯示，刺五加苷E在三年生莖中含量最高，其次為五年生根，考慮到三年生根和五年生根刺五加苷E含量并無顯著性差異，收獲刺五加苷E可考慮在三年采收。異嗪皮啶具有抗腫瘤[20～21]、抗炎及抗感染[22～23]等藥理活性。本研究結(jié)果顯示，異嗪皮啶在三年生根和莖中累積含量最高，故可考慮在三年采收根和莖，以獲得最高含量的異嗪皮啶。

3.2 黃酮類成分在不同培育年限的積累及其最佳采收年限

黃酮類成分也是刺五加中具有藥理活性的一類成分，同樣可發(fā)揮許多藥效。蘆丁是一種常見的黃酮類成分，它存在于多種藥用植物當(dāng)中[24～26]，具有抗菌消炎[26]、抗氧化[27]等藥理活性。本研究結(jié)果顯示，蘆丁在五年生刺五加根和莖中的含量最高，故其最佳采收期為五年。槲皮苷具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及抗癌等廣泛的藥理活性[28]。本研究結(jié)果顯示槲皮苷在五年生莖中含量最高，其次為三年生根，但考慮莖中槲皮苷含量遠高于根，故以槲皮素含量為依據(jù)，刺五加最佳采收年限為五年。金絲桃苷是藥用植物中常見的一種黃酮類次生代謝物，金絲桃苷具有抗急性肝損傷、抗抑郁、抗炎癥、抗血栓、抗癌、抗菌、抗氧化應(yīng)激和抗細胞凋亡等藥理作用[29]。研究結(jié)果表明，金絲桃苷在三年生刺五加莖中含量最高與五年生無顯著性差異，在五年生根中含量顯著高于其他年限。由于莖中金絲桃苷含量遠大于根，故根據(jù)不同生長階段莖中含量確定培育年限為三年。根據(jù)刺五加中黃酮類成分累積規(guī)律，獲得黃酮類成分的最佳采收年限為五年。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)刺五加根和莖中6種主要藥用次生代謝產(chǎn)物含量在不同生長階段具有明顯差異(SPSS軟件差異性分析3個生長階段對刺五加根和莖中主要藥用次生代謝產(chǎn)物含量差異較顯著，P<0.05)，通過主成分分析(Q值)綜合分析6種藥用次生代謝產(chǎn)物在不同培育年限及不同部位的累積情況，結(jié)果顯示五年生刺五加根和莖中6種藥用成分的綜合得分最高。紫丁香苷、金絲桃苷、槲皮苷的最佳采收年限為五年，刺五加苷E、異嗪皮啶、金絲桃苷的最佳采收年限為三年。研究對不同培育年限刺五加根和莖中6種藥用次生代謝產(chǎn)物在不同年限的積累做了初步的研究，可為建立更高效且節(jié)約資源的人工培植刺五加模式提供理論依據(jù)。由于實驗樣本僅采集七臺河單一產(chǎn)地刺五加，不能反映不同產(chǎn)地間及種質(zhì)間的差異，有一定的局限性。進一步研究將探索不同產(chǎn)地及培育年限主要次生代謝物含量變化情況，為中藥材生產(chǎn)實施種植刺五加確定最佳采收年限及采收期提供理論依據(jù)。