冉昆，左新學(xué)，王少敏*

(1.山東省果樹研究所，山東泰安 271000；2.冠縣梁堂鎮(zhèn)林業(yè)站)

微繁技術(shù)(Micropropagation)又稱快速無性繁殖技術(shù)，是指通過植物的胚、組織或器官等進(jìn)行離體無菌培養(yǎng)，迅速獲得大量試管苗的技術(shù)。微繁技術(shù)具有繁殖周期短、繁殖數(shù)量大、可集約化培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。梨的微繁過程包括莖尖培養(yǎng)、增殖、誘導(dǎo)生根及煉苗、移栽等環(huán)節(jié)，目前已廣泛用于西洋梨、白梨、砂梨、秋子梨和新疆梨等。筆者總結(jié)了梨的微繁技術(shù)方案，供參考。

1 培養(yǎng)基類型

梨樹的微繁多采用全量或1/2 MS基本培養(yǎng)基或其改良培養(yǎng)基，也有研究使用LP(Lepoivre)、DKW(Driver-Kuniyuki Walnut)或WPM(Woody Plant Medium)培養(yǎng)基。LP、DKW或WPM培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基主要區(qū)別在于NH4+和NO3-的離子濃度及總離子濃度的差異。影響梨微繁效率的5種主要礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)因子包括NH4NO3、KNO3、中量營(yíng)養(yǎng)元素(Ca-Mg-Cl-Mn-SO4-PO4)、微量元素(Zn、Mn、Cu、Co、Mo、B、I)和乙二胺四乙酸鐵(Fe-EDTA)。通過對(duì)不同基因型梨的分析，確定了對(duì)不同性狀影響最大的因子分別為品質(zhì)(中量營(yíng)養(yǎng)元素、Fe)，葉斑/壞死(中量營(yíng)養(yǎng)元素)，葉片大小(中量營(yíng)養(yǎng)元素)，芽的數(shù)量(NH4NO3、Fe)和芽的長(zhǎng)度(Fe)。通過比較組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài)，確定了梨微繁的最佳增殖培養(yǎng)基，命名為梨培養(yǎng)基1和梨培養(yǎng)基2(表1，表2)。

表1 培養(yǎng)基的母液成分及濃度

表2 MS培養(yǎng)基、梨增殖培養(yǎng)基和梨冷藏培養(yǎng)基配方

注：a表示可以用瓊脂粉和結(jié)冷膠混合物替代。

2 材料

2.1 外植體

休眠期快結(jié)束時(shí)采集已滿足需冷量的枝條，做好標(biāo)記，4℃保存?zhèn)溆?，用于催芽或作為接穗嫁接在砧木上，或在生長(zhǎng)季的早期，從溫室生長(zhǎng)的植株上取幼嫩莖尖。

2.2 所需工具及設(shè)備

100mL燒杯、125mL三角瓶、組培瓶、醫(yī)用紗布、橡皮筋、旋轉(zhuǎn)搖蕩器。組培設(shè)備和工具(超凈工作臺(tái)、解剖刀、解剖剪、鑷子、工具消毒器等)。20%漂白劑(含6%NaOCl或5.7%有效氯)和吐溫20(Tween20)。潤(rùn)濕劑(40L水或液體餐具洗滌劑中加入2mL潤(rùn)濕液Siltwet L-77)。50℃熱水和20℃冷水。殺菌劑NuCop 50，濃度15mL/4L。保鮮劑Floralife。1L三角瓶(用于催芽)。

2.3 培養(yǎng)基

①1/2液體MS培養(yǎng)基[不含PGRs(植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)，pH6.9]，帶蓋污染物檢測(cè)試管16mm×100mm，管內(nèi)含5mL。②污染物檢測(cè)培養(yǎng)基，9cm培養(yǎng)皿中加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)。③增殖培養(yǎng)基，每個(gè)16mm×100mm試管中加入5mL。④增殖培養(yǎng)基，每個(gè)組培瓶中加入40mL。⑤不含PGRs的冷藏培養(yǎng)基。⑥生根培養(yǎng)基，每個(gè)組培瓶中加入40mL。

2.4 莖段冷藏

莖段培養(yǎng)至約5cm，轉(zhuǎn)移至半透明塑料組培袋(StarPac袋)、試管或三角瓶中，接種于不含PGRs的冷藏培養(yǎng)基上。低溫馴化(-1℃ 16小時(shí)黑暗/22℃ 8小時(shí)光照)后，置于培養(yǎng)箱或低溫室中冷藏(1～4℃)。

2.5 馴化材料

無菌灌封的混合或預(yù)制培養(yǎng)基。霧床、透明玻璃試管或玻璃瓶。用于微嫁接的砧木苗。

2.6 微嫁接材料

與微繁莖段具有相同干徑的幼苗。微嫁接后用于覆蓋植株的玻璃瓶或塑料杯。嫁接刀或手術(shù)刀。

2.7 冷凍保存材料

①植株在-1℃16小時(shí)、22℃8小時(shí)條件下馴化1～4周。②裝有預(yù)處理培養(yǎng)基(含5% DMSO和8%瓊脂的MS培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿。③精細(xì)解剖工具及雙目低倍顯微鏡、無菌燒杯和培養(yǎng)皿、2mL無菌移液器、無菌過濾瓶、無菌濾紙。④MS液體培養(yǎng)基(含2M甘油和0.4M蔗糖)。⑤MS液體培養(yǎng)基(含1.2M蔗糖，pH5.8)。⑥恢復(fù)培養(yǎng)基(在小培養(yǎng)皿或多孔板中使用不含生長(zhǎng)素的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基)。⑦凍存管、凍存管架(在冰塊或碎冰中預(yù)冷)、杜瓦(Dewar)瓶(用于盛裝液氮)。

3 梨的微繁方法

梨的微繁效率很大程度上取決于基因型，但也遵循一些適用原則。首先，材料一定要健康、不攜帶病蟲卵；莖段生長(zhǎng)活躍、無病癥。其次，采集莖段后，對(duì)外植體進(jìn)行細(xì)菌和真菌污染物檢測(cè)，選擇無污染的莖段進(jìn)行增殖。再次，確定合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基、冷藏條件、生根步驟及煉苗條件，最終培養(yǎng)出健壯的生根苗。

3.1 培養(yǎng)基配制和滅菌

3.1.1 細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 液體MS檢測(cè)培養(yǎng)基。配制不含PGRs的1/2 MS培養(yǎng)基(pH 6.9)，取5ml加入16mm×100mm試管。輕微蓋上蓋，不要蓋緊，121℃高壓滅菌20分鐘后，將蓋徹底蓋緊。營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar ，NA)檢測(cè)培養(yǎng)基。配制添加1g/L酵母提取物和10g/L葡萄糖NA培養(yǎng)基。滅菌后微冷卻后，倒入9cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿蓋半開，冷卻45分鐘，使多余水分蒸發(fā)。平板可在室溫下倒置保存2個(gè)月。

3.1.2 梨增殖培養(yǎng)基 在燒杯中加入1/2體積的蒸餾水或去離子水，依次加入礦質(zhì)元素、維生素、蔗糖和PGRs，每次加入后攪拌至完全溶解。用蒸餾水或去離子水定容，混勻。用NaOH或H3PO4調(diào)節(jié)pH至5.7。加入瓊脂等固化劑，加熱至瓊脂完全融化，分裝到高壓滅菌的容器中。每個(gè)16mm×100mm離心管中加入5mL培養(yǎng)基用于芽的誘導(dǎo)，每個(gè)組培瓶中加入40mL培養(yǎng)基用于芽的增殖。蓋子先不蓋緊，121℃高壓滅菌20分鐘后，蓋子徹底蓋緊。將增殖培養(yǎng)基保存在干凈的環(huán)境于2周內(nèi)使用。

3.1.3 梨冷藏培養(yǎng)基 冷藏培養(yǎng)基為含1/2 MS氮源、加1g/L瓊脂、不含PGRs的梨培養(yǎng)基2。

3.1.4 梨生根培養(yǎng)基的配制 采用快速浸漬的方法生根，配制不含PGRs的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基；若在含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上生根，按注意事項(xiàng)⑥所述的PGRs濃度配制MS培養(yǎng)基。

3.2 外植體采集及消毒

3.2.1 接穗莖段 在休眠期將結(jié)束時(shí)采集已滿足需冷量的接穗，于4℃保存。在晚冬或早春用劈接法嫁接到砧木幼苗上。嫁接后的植株置于溫室中，生長(zhǎng)至5～10cm時(shí)，采集莖段做外植體。

3.2.2 催芽 從冷庫(kù)中取出接穗，用軟刷在自來水下輕輕刷洗。在含潤(rùn)濕劑(2mL/40L)的50℃循環(huán)水中浸泡10分鐘，立即轉(zhuǎn)移到自來水(-20°C)中水浴10分鐘。然后用流動(dòng)的自來水沖洗，稍晾干，在殺菌劑NuCop 50中(15mL/4L)浸一下(浸銅處理)，徹底吸干水分(浸銅處理時(shí)要戴手套)。使用蒸餾水或去離子水稀釋FloraLife保鮮劑至10g/L，在1L三角瓶中加入500ml。用對(duì)角剪切的方式修剪莖段基部后，接種到組培瓶中，每次剪切后剪子浸在20%漂白水中消毒。將組培瓶置于溫室中培養(yǎng)，每周更換1次保鮮液。芽長(zhǎng)至5～10cm時(shí)，切下3～5cm的莖尖進(jìn)行表面消毒。

3.2.3 外植體的表面消毒 剪下的莖尖放入100mL燒杯中，燒杯口覆蓋紗布，用橡皮筋綁好。燒杯放在塑料盤中，用流動(dòng)的自來水沖洗10分鐘后倒掉水，去除紗布。在裝有外植體的燒杯中加入漂白液(10%漂白粉加入3滴吐溫-20)，放在搖床上搖動(dòng)10分鐘(轉(zhuǎn)速25～30rpm)。把莖段轉(zhuǎn)移到含無菌水的燒瓶中，漩渦2分鐘后，換新的無菌水浸泡2分鐘。

3.2.4 外植體修剪及污染物檢測(cè) 將消毒過的莖段置于無菌濾紙上修剪基部，修剪后置于新的無菌濾紙上。將莖段接種在含1/2液體MS細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基的試管中，做好標(biāo)記。將試管放在培養(yǎng)室中，弱光下培養(yǎng)1周，丟棄染菌的莖段。若1周后培養(yǎng)基無污染，取出外植體，修剪莖段的基部。將莖尖接種到含固體增殖培養(yǎng)基的試管中。剪下的基部在細(xì)菌檢測(cè)平板上劃線，留下一部分接種到NA培養(yǎng)基上。平板做好標(biāo)記并放置3周，觀察細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)狀況。如果NA平板3周后沒有污染，將外植體轉(zhuǎn)移到含增殖培養(yǎng)基的組培瓶中。如已污染，丟棄所有材料。

3.3 增殖

將莖段分為2或3段(3～5cm)，接種至增殖培養(yǎng)基上，每3周更換1次。根據(jù)需要在NA平板上檢測(cè)是否存在細(xì)菌污染。培養(yǎng)條件25℃，16小時(shí)光照，70～100μE/m2·s。

3.4 生根

生根前莖段長(zhǎng)至5cm。剪去莖段的基部，接種到生根培養(yǎng)基上。若采用蘸根的方法，剪去基部，在10mM IBA或NAA中浸漬5秒后，接種到不含PGRs的培養(yǎng)基中，至根系長(zhǎng)至3～5cm。若不生根，在生根劑中浸泡一下，然后移至溫室中生長(zhǎng)。若仍不生根，將莖段微嫁接于干徑相同的砧木上。

3.5 煉苗

組培瓶移至溫室的前2天，打開瓶蓋，便于空氣流動(dòng)。從瓊脂培養(yǎng)基中取出已生根的幼苗，用清水將附著的瓊脂沖洗干凈后，栽植于營(yíng)養(yǎng)缽中并置于霧床上，或用透明的塑料袋、塑料杯或玻璃瓶覆蓋保濕， 2～4周后移至溫室組培架上。

3.6 莖段冷藏

梨的莖段低溫馴化后可在1～4℃條件下保存1～4年，中間不需更換培養(yǎng)基。將莖段接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個(gè)生長(zhǎng)周期(3周)，然后轉(zhuǎn)移至裝有新鮮冷藏培養(yǎng)基的熱密封塑料組培袋中。在生長(zhǎng)室中培養(yǎng)1周后，在低溫條件下馴化1周。馴化條件：1～4℃，低光強(qiáng)(10～20μE/m2·s)或黑暗條件下放置12小時(shí)。一般情況下，莖段的保存時(shí)間為2～3年。保存時(shí)間因基因型而異，所以每隔4～6個(gè)月需對(duì)保存材料進(jìn)行1次評(píng)估，視情況需要重新繁殖。

3.7 冷凍保存(玻璃化程序)

冷凍保存前2天，從低溫馴化的莖段上剪下0.8mm莖尖，并接種到預(yù)處理培養(yǎng)基中[含5%DMSO(二甲基亞砜)、增加1g/L瓊脂的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基]，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天(-1℃16小時(shí)，22℃8小時(shí))。冷凍保存當(dāng)天，配制冷凍保護(hù)劑PVS2(在MS液體培養(yǎng)基中加入30%甘油、15%乙二醇、15% DMSO、0.8M蔗糖，調(diào)節(jié)pH至5.8)，使用前過濾除菌，于4℃保存。注意在試驗(yàn)當(dāng)天將冷凍保護(hù)劑混勻并過濾除菌，試驗(yàn)完成后不要存放。在凍存管中加入1mL上樣溶液(含2M甘油和0.4M蔗糖的MS液體培養(yǎng)基)，將預(yù)處理培養(yǎng)基中的莖尖取出，接種到凍存管中的上樣溶液中，冰浴20分鐘。

玻璃化程序。在小杜瓦瓶中裝滿液氮，用2mL無菌移液器小心吸出凍存管中的上樣溶液，將莖尖留在凍存管中。在凍存管中加入1mL PVS2，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，處理20分鐘(0℃)，注意處理時(shí)間不要過長(zhǎng)，否則對(duì)莖尖會(huì)產(chǎn)生毒害作用。處理結(jié)束時(shí)，將凍存管的蓋子輕輕蓋上(不要太緊，否則液氮會(huì)進(jìn)入凍存管中)，用鑷子將凍存管在液氮中浸15秒。

復(fù)溫程序。從液氮中取出1或2個(gè)凍存管，45℃水浴1分鐘，同時(shí)攪拌。然后25℃水浴(無菌水或干凈的自來水)1～2分鐘。打開蓋子之前先擦干凍存管外壁的水分，用2mL無菌移液器快速吸除1/2體積的PVS2。立即加入1.2M的蔗糖漂洗培養(yǎng)基。去除凍存管中的溶液，并用漂洗培養(yǎng)基重洗2次。將莖尖轉(zhuǎn)移到濾紙上，然后置于恢復(fù)培養(yǎng)基中。莖尖在黑暗中生長(zhǎng)1周后，轉(zhuǎn)移到有光照的組培架上培養(yǎng)。

4 注意事項(xiàng)

①蔗糖是組培中最常用的碳源；瓊脂通常用作培養(yǎng)基的固化劑，也可使用瓊脂和結(jié)冷膠(PhytagelTM或GelriteTM)或玉米淀粉和結(jié)冷膠的混合物。在培養(yǎng)基中加入2～10μM的6-BA可以誘導(dǎo)腋芽生長(zhǎng)。通常情況下，增殖培養(yǎng)基中加入0.01～0.05μM的IBA或NAA，但一般不用GA3，因?yàn)镚A3可能抑制某些基因型的增殖或生根。②在所有組培步驟中，作為外植體的母本質(zhì)量最為重要。應(yīng)選擇健康、無病癥、活躍生長(zhǎng)的莖段。催芽時(shí)，每周換水，莖段用干凈的剪刀修剪。從之前的嫁接株采集外植體很難成功，而且更易產(chǎn)生細(xì)菌污染。嫁接接穗的童性能保持長(zhǎng)達(dá)兩年。③盡早檢測(cè)污染，以免污染源從一個(gè)植株傳到其他植株。將外植體放在含有液體檢測(cè)培養(yǎng)基(1/2 MS，pH 6.9)的試管中培養(yǎng)1周。如果試管變渾濁，說明材料已染菌，丟棄不用；若試管不變渾濁，用外植體的基部在NA平板上劃線，將材料轉(zhuǎn)移至含固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)3周。NA平板用于檢測(cè)其他污染，如觀察到污染，將莖段丟棄；如3周后無污染，則莖段可用于增殖。④使用梨培養(yǎng)基1進(jìn)行芽的誘導(dǎo)。基因型不同，增殖培養(yǎng)基配方也不同。建議先用梨培養(yǎng)基1，若生長(zhǎng)緩慢，再換用梨培養(yǎng)基2。⑤低溫馴化可延長(zhǎng)莖段的保存時(shí)間。多數(shù)情況下，22℃，8小時(shí)光照(10μE/m2·s)和-1℃，16小時(shí)黑暗培養(yǎng)1～2周，對(duì)于多數(shù)基因型效果顯著，可以延長(zhǎng)保存時(shí)間。⑥一般情況下，梨組培苗的生根都需生長(zhǎng)素處理。研究表明，在10mM IBA溶液浸泡15秒對(duì)18份梨種質(zhì)都有效果；12份梨種質(zhì)先在含10mM IBA的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1周后，轉(zhuǎn)移至不含PGRs的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周均可生根；對(duì)其他28份種質(zhì)而言，用IBA生根困難，但用10mM NAA浸泡15秒對(duì)其中的8種基因型有效；10份種質(zhì)可在含10μM NAA的培養(yǎng)基上生根。⑦可通過微嫁接的方法將莖段轉(zhuǎn)移到溫室中培養(yǎng)。將莖段(1.5～3.5cm)從培養(yǎng)容器中取出，用改良劈接法嫁接。砧木可以是嫩枝，也可以木質(zhì)化，但其粗度應(yīng)與接穗的粗度差不多。砧木在距基部合適的距離剪斷，用嫁接刀在砧木干徑中央切0.5cm深的切口，在接穗基部剪一個(gè)V形切口，將接穗插入砧木中，然后用封口膜捆綁好嫁接口后，必須在上面套一個(gè)試管保濕或置于霧床上培養(yǎng)3周，直至嫁接口愈合。之后去除套管，使之適應(yīng)溫室環(huán)境。⑧低氮源培養(yǎng)基對(duì)梨莖段的保存至關(guān)重要。在保存之前的最后一個(gè)生長(zhǎng)周期保持低氮、低營(yíng)養(yǎng)，之后的保存培養(yǎng)基中低氮、高營(yíng)養(yǎng)，保存時(shí)間最長(zhǎng)。⑨PVS2溶液可使細(xì)胞脫水，細(xì)胞內(nèi)殘留的水分與液氮接觸將玻璃化。置于PVS2中時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞將因過度脫水而死亡；而接觸時(shí)間不足，又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成晶體而殺死細(xì)胞。因此，確定最佳的接觸時(shí)間是冷凍保存成功的關(guān)鍵。

5 小結(jié)

梨的微繁過程包括莖尖培養(yǎng)、增殖、誘導(dǎo)生根及煉苗移栽等環(huán)節(jié)。先在1/2 MS培養(yǎng)基(pH6.9)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線培養(yǎng)1周，以檢測(cè)莖段是否存在污染。在梨專用培養(yǎng)基上莖段的增殖和生長(zhǎng)效果更好；與MS培養(yǎng)基相比，梨專用培養(yǎng)基中含4.4μM的6-BA，而且CaCl2、KH2PO4、MgSO4的濃度更高。多數(shù)情況下梨的莖段難以生根。由于基因型的差異，目前尚沒有一種適用于所有梨品種組培苗生根的方法；通常在10mM IBA或NAA中浸漬5秒后，接種到不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基上，可以誘導(dǎo)生根。生根的試管苗可在霧床上進(jìn)行煉苗后移栽。

注：本文摘譯自Reed B M, DeNoma J,Wada S,et al. Micropropagation of pear (Pyrussp.). In: Lambardi M, Ozudogru E, Jain S. Protocols for micropropagation of selected economically-important horticultural plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), 2012, 994. Humana Press, Totowa, N J. 參考文獻(xiàn)略。