羅月芳 唐婕妤 彭菲 譚朝陽

摘要：目的 ?建立益母草懸浮細(xì)胞系，并對其轉(zhuǎn)化生成熊果苷的條件進(jìn)行優(yōu)化。方法 ?以前期實驗優(yōu)選出的愈傷組織為材料建立懸浮細(xì)胞系，加入氫醌并培養(yǎng)一段時間后，測定胞內(nèi)與胞外熊果苷產(chǎn)量，計算轉(zhuǎn)化率。結(jié)果 ?建立的益母草懸浮細(xì)胞系分散性良好，通過生長曲線的測定，確定加入氫醌的最佳時期為接種培養(yǎng)的第6日;通過對不同濃度氫醌、不同轉(zhuǎn)化時間的研究，結(jié)合熊果苷產(chǎn)生的動力學(xué)研究，優(yōu)選出加入3 mmol/L氫醌轉(zhuǎn)化12 h的熊果苷總產(chǎn)量及胞內(nèi)產(chǎn)量最高，氫醌轉(zhuǎn)化率也較高。結(jié)論 ?益母草懸浮細(xì)胞生長速度快，轉(zhuǎn)化氫醌生成熊果苷的能力較強(qiáng)，有望開發(fā)成為新的生物轉(zhuǎn)化體系。

關(guān)鍵詞：益母草;懸浮細(xì)胞;轉(zhuǎn)化;氫醌;熊果苷

中圖分類號：R284.2 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0080-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To establish the suspension cell lines of Leonurus japonicus and optimize the conditions for conversion of hydroquinone to arbutin. Methods The suspension cell lines were established based on the callus optimized in the previous study. After hydroquinone was added to it and cultured for a period of time， the intracellular and extracellular arbutin production were determined and the conversion rate was calculated. Results Well distributed suspension cell lines were established. Through the measurement of growth curve， it was determined that the best period for adding hydroquinone was the sixth day of inoculation culture. By studying the different concentrations of hydroquinone and different transformation time， combined with the kinetics of arbutin production， it was preferred to add 3 mmol/L hydroquinone for 12 h， the total arbutin yield and intracellular yield were the highest， and hydroquinone conversion rate was high. Conclusion With the fast growth rate and strong conversion ability， the suspension cell lines of Leonurus japonicus is expected to develop into a new biotransformation system.

Keywords： Leonurus japonicus; suspension cells; transformation; hydroquinone; arbutin

熊果苷又名熊果素，是一種天然存在的糖苷類物質(zhì)，具有美白、抗?jié)?sup>[1]、抗腫瘤^[2]、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘^[3]等作用，因而應(yīng)用廣泛。從植物中提取熊果苷存在技術(shù)復(fù)雜、效率低、資源依賴性強(qiáng)等問題，比較而言，用植物組織培養(yǎng)方法獲得熊果苷更為高效。如彭飛宇^[4]研究表明，通過黃芩毛狀根將氫醌合成熊果苷的轉(zhuǎn)化率高達(dá)55.6%;彭春秀等^[5]利用白花曼陀羅懸浮培養(yǎng)細(xì)胞糖基化外源氫醌合成熊果苷，約有93.4%的氫醌轉(zhuǎn)化合成了熊果苷。

益母草Leonurus japonicus Houtt.為藥用草本植物，本課題組在前期研究中已篩選出可用于轉(zhuǎn)化氫醌生成熊果苷的優(yōu)良愈傷組織^[6]，但愈傷組織不能準(zhǔn)確控制接種量，轉(zhuǎn)化效率低，不適合擴(kuò)大規(guī)模的生物反應(yīng)器培養(yǎng)。因此，本研究利用該愈傷組織建立懸浮細(xì)胞系，并進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件，對氫醌轉(zhuǎn)化生成熊果苷的動力學(xué)進(jìn)行研究。

1? 儀器與試藥

Breeze2高效液相色譜儀，美國Waters公司;GZX-450E光照培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司;SW-CJ-2D雙人凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電子精密天平，格特勒-托利多儀器（上海）有限公司;TS-2012GZ光照恒溫培養(yǎng)搖床，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司。

熊果苷對照品（批號111951-201301，含量99.6%），中國食品藥品檢定研究院;氫醌（批號201006131，含量99.0%），四川西亞化工股份有限公司。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為去離子水。所用材料為湖南中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實驗室前期誘導(dǎo)與篩選出的益母草疏松愈傷組織。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 益母草懸浮細(xì)胞系的建立

取5 g生長旺盛的疏松愈傷組織，接入含100 mL培養(yǎng)液（MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+2.0 mg/L 6-芐基嘌呤）的250 mL搖瓶中，轉(zhuǎn)速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培養(yǎng)。按新舊液比為3∶1每隔5 d換液。培養(yǎng)前期每次換液時剔除大的細(xì)胞團(tuán)，待培養(yǎng)至有充分的較小細(xì)胞團(tuán)后，換液時將懸浮細(xì)胞液過50目篩，收集濾液，靜置片刻待細(xì)胞下沉，按新舊液比為3∶1棄去上液并補足新液，繼續(xù)搖床培養(yǎng)。多次重復(fù)，培養(yǎng)一段時間后，建立起益母草懸浮細(xì)胞系。此后間歇過50目篩，以維持懸浮細(xì)胞的分散性。

在初期懸浮培養(yǎng)中，細(xì)胞團(tuán)塊較大，細(xì)胞團(tuán)容易沉淀，靜置2 min，懸浮液即清澈透明，換液時棄去大的細(xì)胞團(tuán)。培養(yǎng)一段時間后，靜置2 min，大細(xì)胞團(tuán)雖下沉，但懸浮液不清透，有較多小細(xì)胞團(tuán)懸浮其中。延長靜置時間，從培養(yǎng)瓶底部向上觀察，可見白色的小細(xì)胞團(tuán)。將細(xì)胞過50目篩后，由于生物量驟減，細(xì)胞生長緩慢。隨著培養(yǎng)時間的延長，生物量迅速增加。顯微觀察可見，細(xì)胞團(tuán)較小，分散度、均一性較好。

2.2? 益母草懸浮細(xì)胞系生長曲線測定

將益母草懸浮細(xì)胞種子液以5 g/100 mL培養(yǎng)液接種至250 mL搖瓶。轉(zhuǎn)速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培養(yǎng)。采用分批培養(yǎng)方式，中途不換液，每日收獲3瓶搖瓶，將各瓶懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液混合于抽濾瓶中，抽濾分離細(xì)胞與培養(yǎng)液，測定培養(yǎng)液pH值和懸浮細(xì)胞濕重;將收獲的懸浮細(xì)胞以60 ℃烘干至恒重，測定其干重。

益母草懸浮細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞量的增長情況呈“S”形曲線，延遲期較短;接種后第3日進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞分裂活躍，數(shù)目迅速增加;第8日進(jìn)入平臺期，生長趨于平緩;第13日后，培養(yǎng)瓶內(nèi)某些營養(yǎng)物質(zhì)已耗盡，有毒代謝產(chǎn)物累積，細(xì)胞生長逐漸進(jìn)入衰亡期，生長曲線開始下降。懸浮培養(yǎng)液配制時pH值調(diào)節(jié)為5.8，滅菌后為5.4。在培養(yǎng)過程中，pH值隨培養(yǎng)時間延長和細(xì)胞生物量的增加逐漸增大，這可能與益母草次生代謝生成相關(guān)生物堿有關(guān)，但pH值變化較平緩，最大時僅為5.99，不會影響細(xì)胞生長，無需調(diào)控。

在分批培養(yǎng)中，第8日進(jìn)入平臺期時，益母草懸浮細(xì)胞干重達(dá)1.5 g/瓶，為初始生物量（0.3 g/瓶）4倍以上;細(xì)胞濕重達(dá)32 g/瓶，達(dá)初始生物量的6倍。

綜上，考慮細(xì)胞活力和細(xì)胞生物量兩方面因素，益母草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)可選擇在接種后第6～8日（接種當(dāng)日記為第0日）繼代或做轉(zhuǎn)化實驗。

2.3? 熊果苷含量檢測

2.3.1? 供試品溶液的制備

將收獲的3瓶懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液混合，抽濾，細(xì)胞殘渣用水清洗3遍，和濾液一起置-80 ℃保存。測定時取出解凍，細(xì)胞殘渣加10倍量70%甲醇，于80 ℃回流1 h，冷卻后補足減失的質(zhì)量，過0.45 ?m濾膜;培養(yǎng)液即濾液直接解凍后過0.45 ?m濾膜，即得。

2.3.2? 對照品溶液的制備

取熊果苷、氫醌對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成每1 mL含0.05 mg的混合溶液，即得。

2.3.3? 色譜條件

采用Ultimate XB-C18（HS）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（5∶95），檢測波長285 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫30 ℃。

2.4? 不同濃度氫醌和轉(zhuǎn)化時間對益母草懸浮細(xì)胞生成熊果苷的影響

以5 g/100 mL接入益母草懸浮細(xì)胞種子液，轉(zhuǎn)速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培養(yǎng)。接種后第6日上午同時添加1、3、6 mmol/L氫醌，于12、24、48 h后分批取樣，按“2.3”項下方法檢測，并計算熊果苷轉(zhuǎn)化率。熊果苷轉(zhuǎn)化率（%）=（轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)物中所含熊果苷摩爾數(shù)+培養(yǎng)液中熊果苷摩爾數(shù)）÷加入培養(yǎng)體系中的氫醌總摩爾數(shù)×100%。

相同濃度條件下，隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，熊果苷在胞內(nèi)產(chǎn)量逐漸減少，胞外產(chǎn)量增加;1 mmol/L氫醌轉(zhuǎn)化24 h時轉(zhuǎn)化率最高，6 mmol/L氫醌轉(zhuǎn)化48 h時總產(chǎn)量最高。

相同轉(zhuǎn)化時間，隨氫醌濃度增加，熊果苷胞外含量明顯增大，轉(zhuǎn)化率明顯降低;熊果苷總產(chǎn)量隨氫醌量增加和轉(zhuǎn)化率降低雙重影響而波動，1 mmol/L氫醌轉(zhuǎn)化24 h時轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)56.32%;6 mmol/L氫醌組轉(zhuǎn)化48 h熊果苷總產(chǎn)量最高，達(dá)64.49 mg，但轉(zhuǎn)化率只有13.16%。

2.5? 益母草懸浮細(xì)胞生成熊果苷的動力學(xué)研究

以5 g/100 mL接入益母草懸浮細(xì)胞種子液，轉(zhuǎn)速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培養(yǎng)。接種后第6日上午同時添加終濃度2 mmol/L氫醌，搖瓶全避光處理，分批于不同時間取樣，按“2.3”項下方法檢測熊果苷含量。可見，添加氫醌1 h，即可在細(xì)胞內(nèi)檢測到熊果苷;3 h時，培養(yǎng)液中能檢測到微量熊果苷;6 h時，胞內(nèi)熊果苷產(chǎn)量最高，之后持續(xù)下降;36 h時，胞內(nèi)熊果苷產(chǎn)量已基本降到最低值，而胞外產(chǎn)量達(dá)到峰值，但此時胞內(nèi)熊果苷產(chǎn)量并非為0，96 h時仍有部分細(xì)胞有活性。

3? 討論

本研究以前期篩選出的疏松愈傷組織為材料建立了益母草懸浮細(xì)胞系。懸浮培養(yǎng)第3日進(jìn)入對數(shù)生長期，第8日進(jìn)入平臺期，此時益母草懸浮細(xì)胞干重和濕重較初始生物量分別增加了4、6倍，與姜新超^[7]報道百合懸浮細(xì)胞增殖結(jié)果類似。結(jié)果表明，已建立的分散均勻、細(xì)胞團(tuán)顆粒小的懸浮系在旺盛生長期可繼代或作為種子液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，以進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)化實驗。

在不同氫醌濃度和轉(zhuǎn)化時間研究中，總體來說，轉(zhuǎn)化時間延長或氫醌濃度增大都會導(dǎo)致熊果苷胞內(nèi)產(chǎn)量減少、胞外產(chǎn)量增多;氫醌濃度越低，轉(zhuǎn)化率越高，利用度越充分;氫醌濃度越高，熊果苷產(chǎn)出量越多，但轉(zhuǎn)化率下降。綜合考慮熊果苷轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)量、提取分離成本，認(rèn)為在3 mmol/L氫醌濃度轉(zhuǎn)化12 h時收獲最好，此時熊果苷基本在胞內(nèi)，熊果苷總產(chǎn)量為58.63 mg，且氫醌轉(zhuǎn)化率較高。胞內(nèi)濃度高，有利于后期提取分離。

在益母草懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的動力學(xué)研究中，熊果苷總產(chǎn)量在轉(zhuǎn)化6 h時達(dá)到峰值，隨后以24 h為周期出現(xiàn)波動。由于自添加氫醌起，搖瓶處于全避光狀態(tài)培養(yǎng)，可以排除光照改變導(dǎo)致熊果苷產(chǎn)量波動。隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，收獲的細(xì)胞鮮重減少，培養(yǎng)液體積增多，說明細(xì)胞受氫醌毒性死亡，胞液釋放，故細(xì)胞鮮重持續(xù)減少，培養(yǎng)液體積持續(xù)增多。推測益母草懸浮細(xì)胞在添加氫醌前一直處于光暗交替下培養(yǎng)，帶有一定的生理周期，所以在轉(zhuǎn)化合成熊果苷時呈現(xiàn)周期性波動，且外界周期自夜間至晨間時熊果苷產(chǎn)出量高。

綜上，隨著轉(zhuǎn)化時間延長或氫醌濃度增大，熊果苷以在胞內(nèi)為主逐漸轉(zhuǎn)變成以胞外為主，最終全部轉(zhuǎn)到胞外;胞內(nèi)與胞外含量呈明顯的消長關(guān)聯(lián)性。結(jié)合動力學(xué)研究分析其原因，氫醌對細(xì)胞有一定毒性，隨濃度的提高和時間的延長，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶酶體釋放，細(xì)胞出現(xiàn)自溶，胞外熊果苷是細(xì)胞大量解體將胞內(nèi)熊果苷釋放到胞外的結(jié)果。

植物懸浮細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的動力學(xué)研究迄今少有報道。本研究結(jié)果可為其他生物轉(zhuǎn)化研究提供借鑒。利用益母草懸浮細(xì)胞系通過生物轉(zhuǎn)化得到熊果苷，可豐富熊果苷的來源途徑。

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