孔祥穎 甘富斌 高興 張文華 蔡金山 李家奎

摘要：肝片吸蟲(chóng)病是一種由肝片吸蟲(chóng)和大片吸蟲(chóng)寄生于人和牛、羊等反芻動(dòng)物的肝臟膽管所致的人畜共患寄生蟲(chóng)病。于2017年在青海省海北州某屠宰場(chǎng)進(jìn)行牦牛寄生蟲(chóng)病調(diào)查時(shí)，在患病牦牛肝臟采集到吸蟲(chóng)樣本，經(jīng)蟲(chóng)體形態(tài)學(xué)觀察、PCR鑒定，查明該蟲(chóng)體為大片吸蟲(chóng)，該研究為首次報(bào)道牦牛大片吸蟲(chóng)，可為牦牛該病的防治提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：牦牛;大片吸蟲(chóng);形態(tài)觀察;PCR鑒定

中圖分類號(hào)：S852.73+5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2019）01-0005-02

肝片形吸蟲(chóng)病是一種以肝片吸蟲(chóng)和大片吸蟲(chóng)為病原的重要的人畜共患寄生蟲(chóng)病，主要寄生于動(dòng)物的肝臟、膽管、膽囊中，以破壞動(dòng)物肝臟、膽管而引起急性、慢性肝炎和膽管炎[1]，并使患病動(dòng)物伴有貧血、水腫、食欲不振、全身性中毒等癥狀，輕者可導(dǎo)致患病動(dòng)物消瘦，重者可導(dǎo)致患病動(dòng)物大批死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2，3]。

牦牛主要分布于我國(guó)的青藏高原及毗鄰地區(qū)，適應(yīng)高寒生態(tài)條件，耐粗、耐勞，善走陡坡險(xiǎn)路、雪山沼澤，能游渡江河激流，有“高原之舟”之稱[4，5]。當(dāng)牦牛采食沼澤、潮濕、坑洼等草地的牧草時(shí)，容易感染肝片吸蟲(chóng)病，造成牦牛大量死亡，給牧民帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失[6，7]。筆者在青海患肝片吸蟲(chóng)病牦牛身上采集到蟲(chóng)體樣本，經(jīng)壓片觀察、PCR鑒定后，確認(rèn)為牦牛大片吸蟲(chóng)，該研究將為牦牛大片吸蟲(chóng)病的診斷提供參考[2，8，9]。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)用蟲(chóng)體來(lái)源

2017年自青海海北州某屠宰場(chǎng)進(jìn)行牦牛寄生蟲(chóng)病調(diào)查時(shí)，在牦牛肝臟中采集到蟲(chóng)體樣本，疑似肝片吸蟲(chóng)，經(jīng)95%的乙醇固定，待檢。

1.2? DNA提取

將蟲(chóng)體用研缽磨碎，加入裂解液使細(xì)胞充分裂解，用氯仿提取DNA，以氮吹儀吹干，最后再溶解，于4 ℃保存。

1.3? PCR方法

擴(kuò)增的引物是Itagaki等所發(fā)表的引物，上游引物為5′_AAGGATGTGCTTTGTCGTGG_3′，下游引物為5′_AGGCCCCTTACGAATCTGCAT_3′。反應(yīng)體系為25 μL，其中蒸餾水5.5 μL，Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃后延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，觀察并記錄結(jié)果。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物送到擎科生物科技有限公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 牦牛大片吸蟲(chóng)的形態(tài)觀察

眼觀和顯微鏡觀察，牦牛大片吸蟲(chóng)蟲(chóng)體長(zhǎng)37～76 mm、寬5～10 mm，竹葉狀。與肝片形吸蟲(chóng)的區(qū)別在于：前者前端無(wú)顯著的圓錐突出，在頭部后面即逐漸擴(kuò)大直至腹吸盤(pán)水平處，蟲(chóng)體的邊幾成平行，后端不縮小;腹吸盤(pán)較大，其腔通常向后延長(zhǎng)，并形成盲囊。大片形吸蟲(chóng)的咽較食道長(zhǎng)，腸管的內(nèi)側(cè)分支很多，并有明顯的小支，睪丸分支較少，所占的空間及其長(zhǎng)度較小。牦牛大片吸蟲(chóng)形態(tài)和報(bào)道的大片吸蟲(chóng)形態(tài)相似[10]。

2.2? 測(cè)序結(jié)果及NCBI GenBank比較

經(jīng)擴(kuò)增得到514 bp的片段，G+C含量為38.3%。同NCBI GenBank已發(fā)表的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，與KF543343.1、MF430857.1等相似度達(dá)到99%，與KF687892.1相似度更是高達(dá)100%（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）[11]?？梢源_定該蟲(chóng)體樣本為大片吸蟲(chóng)。

3? 討論

牦牛肝片吸蟲(chóng)病是由肝片吸蟲(chóng)和大片吸蟲(chóng)引起的一種寄生蟲(chóng)病，嚴(yán)重影響牦牛的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至引起大批死亡[12，13]。該病在我國(guó)牦牛產(chǎn)區(qū)十分常見(jiàn)，常造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。但在以往的報(bào)道中，肝片吸蟲(chóng)病多由肝片吸蟲(chóng)引起，大片吸蟲(chóng)少有報(bào)道。目前已見(jiàn)報(bào)道的牛的大片吸蟲(chóng)僅有水牛，本試驗(yàn)證實(shí)了牦牛體內(nèi)大片吸蟲(chóng)的存在，為牦牛大片吸蟲(chóng)的診治奠定了基礎(chǔ)。

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