楊燕燕，謝金東，周建華，俞春英，林 瑋，劉德強(qiáng)，王訓(xùn)立

(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種復(fù)雜的多因素疾病，表現(xiàn)為動(dòng)脈壁對(duì)各種炎癥損傷的炎癥-增殖反應(yīng)[1-2]。目前，AS防治措施有多種選擇，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)雖能緩解AS心肌缺血癥狀，但容易發(fā)生術(shù)后再狹窄；他汀類西藥可迅速、有效的治療AS，但作用單一，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致明顯的不良反應(yīng)；而多種中藥也被用于防治AS疾病，并提示具有一定程度的療效[3]。近年來(lái)，靈芝的抗AS作用機(jī)制研究多數(shù)是基于大鼠動(dòng)物模型進(jìn)行的血脂監(jiān)控及病理形態(tài)學(xué)分析[4]，但靈芝多糖(ganoderma lucidum polysaccharides, GLPs)治療AS涉及炎癥因子和免疫反應(yīng)的分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究基于ApoE-/-小鼠AS模型和TLR/NF-κB信號(hào)通路，分析GLPs對(duì)TLR4及其下游MyD88依賴性或非依賴性信號(hào)通路的影響，探討其對(duì)AS干預(yù)作用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

8～10周齡ApoE-/-小鼠50只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、GLPs低劑量組(200 mg/kg·d)、GLPs中劑量組(500 mg / kg·d)、GLPs高劑量組(800 mg / kg·d)及辛伐他汀組(1.8 mg / kg·d)各10只，8～10周齡C57BL/6小鼠10只，設(shè)為正常對(duì)照組。小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0002)，喂飼于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SYXK(閩)2014-0005)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要儀器與試劑

美國(guó)ABI 2720 PCR擴(kuò)增儀；美國(guó)賽默飛世爾17R小型高速冷凍離心機(jī)；美國(guó)ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀；美國(guó)Biorad Mini-PROTEAN@Tetra小型垂直電泳槽；美國(guó)Biorad Power Pac電泳儀；美國(guó)Biorad ChemiDoc XRS +凝膠成像分析系統(tǒng)；普通二級(jí)清潔飼料，高脂飼料(1%膽固醇，10%豬油，89%基礎(chǔ)飼料)；生物工程(上海)股份有限公司SK1312 Total RNA Extractor試劑盒；生物工程(上海)股份有限公司SK2445第一鏈cDNA合成試劑盒；生物工程(上海股份有限公司)B639273 2X SG Fast qPCR Master Mix(High Rox)；GLPs購(gòu)自杭州眾芝康菇生物科技有限公司；TLR4、NF-κB、MyD88等抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；TRAF6、TRIF等抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；TRAM抗體購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司；Pierce Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP Antibody和Pierce Goat Anti-Rabbit IgG-HRP Antibody購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

2 方法

2.1 AS動(dòng)物模型制作

正常組小鼠喂飼普通飼料，ApoE-/-小鼠給予高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)共90 d。造模后期按照各藥物干預(yù)組設(shè)定劑量每日灌胃給藥1次，正常組和模型組給予等量生理鹽水，治療期為30 d。解剖取病變主動(dòng)脈血管，驗(yàn)證AS疾病模型造模成功與否并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

表1顯示，血管組織總RNA提取步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系得到cDNA，參照Gene Bank，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)總體系20.0 μL：2×SybrGreen qPCR Master Mix 10.0 μL，Template cDNA 2.0 μL，10 μM PCR Forward Primer 0.4 μL，10 μM PCR Reverse Primer 0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min,95 ℃ 7 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共45個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，數(shù)據(jù)計(jì)算依據(jù)2-ΔΔCT法[5]。

表1 各基因的引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度

2.3 Western Blot

提取動(dòng)脈總蛋白，基于BCA法定量配制上樣蛋白樣品，SDS-PAGE垂直板全濕法電泳；轉(zhuǎn)于PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h，加入1∶1 000 稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌；加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，洗滌后ECL顯色；經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，分析各組目標(biāo)條帶的灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 ApoE-/-小鼠AS模型建立

圖1 小鼠動(dòng)脈病理組織學(xué)比較

圖1表2顯示，正常組主動(dòng)脈壁層次清晰，內(nèi)膜連續(xù)，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)AS斑塊形成。模型組則顯示主動(dòng)脈管壁厚薄不均，血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)部脂質(zhì)池增大，管腔內(nèi)斑塊沉積，有泡沫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)為典型的AS病理特征。同時(shí)血清血脂水平檢測(cè)顯示，模型組TC、TG、LDL-C水平顯著升高，而HDL-C顯著降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；谏鲜鲎C實(shí)，ApoE-/-小鼠AS模型建立成功。

3.2 RNA提取及降解狀況

圖2顯示，小鼠動(dòng)脈組織總RNA條帶的18S、28S條帶清晰完整，基本無(wú)降解。

表2 正常組和模型組小鼠血脂水平比較

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.3 靈芝多糖對(duì)TLR4及其下游MyD88信號(hào)通路元件表達(dá)的影響

3.3.1 TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF-6 mRNA表達(dá) 表3顯示，與正常組比較，模型組TLR4(P<0.05)、NF-κB(P<0.05)、MyD88(P<0.05)和TRAF-6(P<0.01)mRNA表達(dá)顯著升高。與模型組比較，經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF-6 mRNA表達(dá)均有不同程序的降低。其中西藥對(duì)照組效果最為明顯，TLR4、MyD88及NF-κB mRNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TRAF-6 mRNA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而中藥GLPs治療組與模型組比較則表現(xiàn)為低劑量組NF-κB、中劑量組MyD88和高劑量組TLR4、NF-κB、MyD88 mRNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)GLPs各劑量組的TRAF-6 mRNA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 RNA檢測(cè)電泳結(jié)果

3.3.2 TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF-6蛋白表達(dá) 表3顯示，各組的蛋白相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)與mRNA基本一致。與正常組比較，模型組TLR4(P<0.01)、NF-κB(P<0.05)、MyD88(P<0.05)和TRAF-6(P<0.01)蛋白表達(dá)顯著升高。與模型組比較，經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組各指標(biāo)蛋白表達(dá)均有不同程序的降低，其中西藥對(duì)照組最為明顯，TLR4、MyD88及NF-κB差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TRAF-6差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而中藥GLPs治療組與模型組比較，則表現(xiàn)為高劑量組TLR4和中、高劑量組的NF-κB、MyD88蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)GLPs各劑量組的TRAF-6比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組小鼠TLR4及其下游MyD88依賴性通路元件mRNA和蛋白表達(dá)水平比較(相對(duì)表達(dá)量，

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

3.4 靈芝多糖對(duì)MyD88非依賴性信號(hào)通路元件表達(dá)的影響

3.4.1 TRAM和TRIF mRNA表達(dá) 表4顯示，與正常組比較，模型組TRAM(P<0.05)和TRIF(P<0.01)mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組TRAM和TRIF mRNA表達(dá)均有下降趨勢(shì)，西藥對(duì)照組效果較為明顯(P<0.05)，但GLPs各劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

3.4.2 TRAM和TRIF 蛋白表達(dá) 表4顯示，各組TRAM和TRIF蛋白相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)與mRNA基本一致。與正常組比較，模型組TRAM(P<0.05)和TRIF(P<0.01)蛋白表達(dá)水平顯著升高。與模型組比較，經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組TRAM和TRIF蛋白均具有下降趨勢(shì)，西藥對(duì)照組效果較為明顯(P<0.05)，但GLPs各劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

4 討論

TLR4貫穿于AS起始、進(jìn)展、斑塊不穩(wěn)定及斑塊破裂等各個(gè)時(shí)期[6]。MyD88依賴性途徑表現(xiàn)為介導(dǎo)IRAK-1和IRAK4結(jié)合TLR4，IRAK-1自磷酸化后解離、募集并活化下游TRAF-6，隨后活化TAK1，激活I(lǐng)KK復(fù)合體，誘導(dǎo)IκB磷酸化并釋放NF-κB轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，經(jīng)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)早期的天然免疫及炎癥反應(yīng)[7-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠TLR4及下游MyD88依賴性信號(hào)通路主要細(xì)胞因子TLR4、NF-κB、MyD88及TRAF-6 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高。采用GLPs干預(yù)后，各指標(biāo)表達(dá)均有不同程度下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，推測(cè)GLPs對(duì)TLR4及下游MyD88依賴性信號(hào)通路有一定程度的拮抗作用，對(duì)TLR4介導(dǎo)的TLR4/MyD88/NF-κB通路可能具有阻斷作用。而各劑量組的TRAF6表達(dá)水平與模型組比較下降趨勢(shì)最為顯著，這可能是由于TRAF6處于TLR信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥活化反應(yīng)的中心點(diǎn)，起著至關(guān)重要的橋梁作用。這與AS發(fā)病機(jī)制的主流學(xué)說(shuō)“炎癥學(xué)說(shuō)”相一致[10]。

表4 各組小鼠MyD88非依賴性通路元件mRNA和蛋白表達(dá)水平比較(相對(duì)表達(dá)量，

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

注：1.正常組；2.模型組；3.辛伐他汀對(duì)照組；4.靈芝多糖低濃度組；5.0靈芝多糖中濃度組；6.靈芝多糖高濃度組圖3 各組小鼠TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF-6蛋白表達(dá)比較

注：1.正常組；2.模型組；3.辛伐他汀對(duì)照組；4.靈芝多糖低濃度組；5.靈芝多糖中濃度組；6.靈芝多糖高濃度組圖4 各組小鼠TRAM和TRIF蛋白表達(dá)比較

TLR4還可不依賴MyD88激活I(lǐng)RF-3、IRF-7和NF-κB，通過(guò)相關(guān)接頭分子TRAM作用于TRIF，隨后結(jié)合TRAF6并活化IKK復(fù)合體，致使IκB泛素化，最終NF-κB釋放至細(xì)胞核，一系列炎癥反應(yīng)由此產(chǎn)生[11]。而當(dāng)前研究提示，MyD88非依賴途徑僅存在于TLR3和TLR4通路中[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠TRAM、TRIF mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，采用GLPs干預(yù)后指標(biāo)表達(dá)有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，推測(cè)GLPs對(duì)TLR4介導(dǎo)的MyD88非依賴性信號(hào)通路可能無(wú)阻斷作用。

在AS療效方面，中藥治療組的療效不如西藥對(duì)照組，并未顯示出明顯的濃度依賴性。這與中藥在適當(dāng)劑量時(shí)起效慢、療程長(zhǎng)的現(xiàn)象相吻合。GLPs空間構(gòu)型復(fù)雜，本身即具有雙向調(diào)節(jié)作用，而此調(diào)節(jié)作用主要受藥物劑量、配伍、炮制加工、藥物代謝動(dòng)力學(xué)等因素的影響。因此，GLPs適宜劑量還需通過(guò)調(diào)整相應(yīng)用藥量、用藥時(shí)間及方式來(lái)加以改善。與此同時(shí)，GLPs發(fā)揮免疫功能和抗炎效用的分子機(jī)制目前尚無(wú)具體定論[14-16]。其抗AS分子機(jī)制除TLRs/TLR4之外，可能還存在同時(shí)與多種受體結(jié)合，激活多條信號(hào)通路相互作用，而多糖與受體親和力的差異又將導(dǎo)致不同傳導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞激活效應(yīng)的不同。因此，各種細(xì)胞表面模式識(shí)別受體的相互拮抗或協(xié)同調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。