楊 寰，杜金城，杜鋼軍

(1. 開封市中醫(yī)院藥劑科，河南 開封 475001； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；3. 河南大學(xué)藥學(xué)院，河南 開封 475004)

皮膚腫瘤是發(fā)生于身體暴露部位惡性腫瘤的統(tǒng)稱，系表皮角質(zhì)形成細(xì)胞惡性增生的結(jié)果[1]，產(chǎn)生的病因目前尚不清楚。左金丸源于《丹溪心法》，由黃連和吳茱萸按6∶1組成，有清肝瀉火、降逆止嘔的功效[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，其對(duì)胃癌、乳腺癌、大腸癌等均有防治作用[3-5]，但對(duì)皮膚腫瘤是否具有防治作用尚未有報(bào)道。動(dòng)物模型是腫瘤相關(guān)研究的重要工具，本研究采用與人體皮膚腫瘤發(fā)病機(jī)制相似的DMBA/TPA二階段小鼠皮膚腫瘤模型，觀察左金丸對(duì)皮膚癌的預(yù)防作用，為左金丸防治皮膚腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明雌性小鼠，體質(zhì)量20～24 g，購于河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 (動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(豫)2015-0002)。

1.2 藥品及試劑

左金丸按原方中所含中藥黃連和吳茱萸6∶1的比例稱取中藥配方顆粒(黃連、吳茱萸均購開封天濟(jì)堂大藥房，由開封市中醫(yī)院藥劑科中藥室楊寰主管藥師鑒定為正品，并制備為配方顆粒。配方顆粒劑中黃連、吳茱萸顆粒劑為 1 g相當(dāng)于飲片5 g)組成，用時(shí)按需要用生理鹽水溶成所需溶液。二甲基苯蒽(批號(hào)160839)、巴豆油(批號(hào)160218)、多聚甲醛(批號(hào)160423)和蘇木精(批號(hào)150622)購自美國(guó) sigma 公司；PCNA、E-cadherin、N-cadherin、HRP-羊抗兔二抗(批號(hào)20160908)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；IL-1、IL-6、hs-CRP、TNF-α和AEC試劑盒(批號(hào)20160912)，購自美國(guó)安迪生物技術(shù)有限公司；AST、ALT和肌酐試劑盒(批號(hào)20160815)，購自南京建成生物工程研究所；免疫組化試劑盒(批號(hào)20160910)，購自武漢博士德生物工程有限公司，其余試劑均為市售分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

FA1004 N型電子天平，上海精密儀器有限公司；YLA-1 A型多功能小鼠自主活動(dòng)儀，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；XFA6130全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀，南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司；ELX-800UV型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；RM2235型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司；BX43病理圖像分析系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 皮膚腫瘤模型建立與分組

昆明雌鼠用蒸餾水將背部的皮膚潤(rùn)濕(2×2 cm 左右的面積)，取脫毛膏適量均勻涂抹在小鼠背部。5 min 之后，觀察到背毛已溶解時(shí)，輕輕用溫水擦掉殘留的脫毛膏和已溶解的背毛，然后用干毛巾將小鼠背部脫毛處擦干。將背部脫毛小鼠75只按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和左金丸組，每組小鼠各25只。分組次日，模型組和左金丸組用75 mg/100 ml 的二甲基苯蒽丙酮液0.2 ml涂于小鼠背部脫毛處，每周1次，連涂3周。從第4 周開始，在小鼠背部二甲基苯蒽誘瘤部位涂0.25 ml/100 ml 的巴豆油丙酮液0.2 ml，每周 2 次，直到皮膚乳狀肉瘤數(shù)目保持2周不再增加，停止涂抹巴豆油，終結(jié)實(shí)驗(yàn)。正常組與模型組平行僅涂相同容量的丙酮。

2.2 藥物預(yù)防

小鼠第1次涂二甲基苯蒽丙酮液后次日，左金丸組按人體等效劑量原藥材0.75 g/kg體質(zhì)量將配方顆粒溶成0.75%的溶液，以0.2 ml/10 g體質(zhì)量給小鼠灌胃，每日2次，每周給藥6 d。正常組和模型組平行灌胃等容量生理鹽水。

2.3 常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)

每日觀察小鼠活動(dòng)、毛色是否正常，如有死亡解剖檢查原因。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1周記錄飲食量，計(jì)算平均每只小鼠的周飲食量；實(shí)驗(yàn)結(jié)束前2 d自主活動(dòng)儀檢測(cè)自主活動(dòng)，計(jì)算平均每只小鼠10 min內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠眼眶靜脈叢采血，血液細(xì)胞分析儀自動(dòng)完成紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)，并自動(dòng)計(jì)算血紅蛋白含量，其中白細(xì)胞計(jì)數(shù)包含占白細(xì)胞比例較多的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)；部分血清用試劑盒檢測(cè)AST、ALT和肌酐含量。

2.4 腫瘤相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

記錄小鼠皮膚乳狀肉瘤肉眼可見出現(xiàn)時(shí)間及每只小鼠每周的皮膚乳狀肉瘤數(shù)目，待皮膚乳狀肉瘤數(shù)目穩(wěn)定2周后終結(jié)實(shí)驗(yàn)。各組小鼠計(jì)數(shù)皮膚乳狀肉瘤數(shù)目后眼眶靜脈采血分離血清，按試劑盒說明檢測(cè)IL-1、IL-6、hs-CRP和TNF-α含量。之后處死小鼠，取皮膚致瘤組織做免疫組化染色，分析皮膚組織中E-Cadherin、N-Cadherin和增殖標(biāo)志PCNA表達(dá)強(qiáng)度，評(píng)價(jià)左金丸對(duì)小鼠皮膚腫瘤的預(yù)防效果。

免疫組化過程與評(píng)價(jià)方法如下： 將皮膚致瘤組織0.38%的多聚甲醛PBS中性溶液固定48 h后常規(guī)酒精梯度脫水、石蠟包埋，切成4 μm后的切片后貼附于防脫載玻片上，經(jīng)常規(guī)脫蠟和水化后于3%H2O2溶液中室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;將切片放入檸檬酸緩沖液微波煮沸5 min×2次修復(fù)抗原;5%BSA 室溫封閉20 min，傾去多余液體，滴加1∶50 稀釋的E-Cadherin、N-Cadherin和PCNA兔抗鼠多克隆抗體，4 ℃過夜;PBS洗3次后生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min;PBS沖洗3次后滴加 SABC，37 ℃ 孵育 20 min;PBS沖洗3次后AEC顯色劑顯色，蘇木素輕度復(fù)染核，封片后在光鏡下觀察。采用半定量方法表達(dá)結(jié)果，切片的染色強(qiáng)度記分:0分：染色為陰性;1分：染色為弱陽性(淺紅棕色);2分：染色為陽性(紅棕色); 3分：染色為強(qiáng)陽性(深紅棕色)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 左金丸對(duì)小鼠常規(guī)指標(biāo)的影響

表1顯示，與正常小鼠比較，模型組和左金丸組小鼠食量和自主活動(dòng)均有減少趨勢(shì)(P>0.05)，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)均明顯升高(P<0.05)，但模型組和左金丸組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)其他代表肝功能的血清AST和ALT含量(P>0.05)，代表腎功能的血清肌酐含量(P>0.05)，代表血液毒性的血紅蛋白含量(P>0.05)、紅細(xì)胞和血小板數(shù)(P>0.05)進(jìn)行常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)，正常組小鼠、模型組和左金丸組小鼠組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 左金丸對(duì)小鼠常規(guī)指標(biāo)的影響

注：與模型組比較：*P<0.05

3.2 左金丸對(duì)小鼠皮膚腫瘤相關(guān)指標(biāo)的影響

表2顯示，模型組和左金丸組小鼠到實(shí)驗(yàn)終結(jié)時(shí)外觀和活動(dòng)均無異常的小鼠有20只，模型組小鼠成瘤時(shí)間始于誘癌后第6周，第10周后腫瘤數(shù)量不再增加，20只小鼠全部出現(xiàn)皮膚腫瘤；左金丸組小鼠成瘤時(shí)間始于誘瘤后第8周, 第10周后腫瘤數(shù)量不再增加，20只小鼠中14只出現(xiàn)皮膚腫瘤，腫瘤發(fā)生率和平均每只小鼠致瘤數(shù)與模型組比較均有顯著減少(P<0.01)。與正常小鼠比較，模型組小鼠血清IL-1、IL-6、hs-CRP和TNF-α炎癥因子均明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，左金丸對(duì)上述血清炎癥因子均有顯著降低作用(P<0.01)。

表2 左金丸對(duì)小鼠皮膚腫瘤相關(guān)指標(biāo)的影響

注：與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

表2圖1顯示，與正常組小鼠比較，模型組小鼠皮膚組織E-Cadherin明顯降低、N-Cadherin明顯升高，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化增強(qiáng)(P<0.01)，增殖標(biāo)志物PCNA明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，左金丸對(duì)皮膚組織上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和增殖均有顯著降低作用(P<0.05)。

圖1 左金丸對(duì)小鼠皮膚組織上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和增殖的影響(免疫組化 ×200)

4 討論

皮膚腫瘤可能的因素有紫外光照射、長(zhǎng)期不愈的慢性潰瘍、燒傷瘢痕等，一旦發(fā)生可向內(nèi)臟轉(zhuǎn)移致死，目前尚無十分有效的治療藥物[6]。中藥具有未病先防的優(yōu)勢(shì)，很明顯不論從花費(fèi)還是從療效上都要優(yōu)于發(fā)病后的治療。左金丸僅由黃連和吳茱萸2味藥組成，方中黃連苦寒、清熱燥濕、瀉火解毒，吳茱萸辛苦且熱、辛散溫通、溫肝暖腎，兩藥寒熱配對(duì)，共奏清瀉肝火、降逆和胃、開郁散結(jié)之功。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,皮膚腫瘤是內(nèi)有痰濁、外有火毒、風(fēng)毒相搏、氣滯血瘀等致病因素引起[7]。本研究結(jié)果表明，左金丸按人體等效劑量給藥對(duì)二甲基苯蒽/巴豆油誘導(dǎo)小鼠皮膚腫瘤不僅減少腫瘤數(shù)目，也降低致腫瘤小鼠數(shù)量，為其用于防治皮膚腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也符合中藥重視清除毒邪、消除腫瘤因毒而生病因的防治原則[8]。

目前研究顯示，黃連-吳茱萸藥對(duì)主要功效物質(zhì)基礎(chǔ)為生物堿類成分，黃連中的黃連素和吳茱萸的吳茱萸堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有直接生長(zhǎng)抑制作用[9-10]，應(yīng)該是左金丸防治腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)。龔夢(mèng)鵑等對(duì)左金丸血清藥物化學(xué)進(jìn)行初步研究，口服左金丸水煎液后在大鼠血清中發(fā)現(xiàn)14個(gè)入血成分，其中5個(gè)為原型成分，9個(gè)為代謝產(chǎn)物[11]。腫瘤發(fā)生不論外因主導(dǎo)還是內(nèi)源性機(jī)制，致病因素持續(xù)存在引起的持續(xù)性炎癥損傷和修復(fù)決定了腫瘤以 “慢性炎癥”為特征的病理特點(diǎn)[12]。本研究結(jié)果表明，左金丸對(duì)皮膚腫瘤小鼠血清IL-1、IL-6、hs-CRP和TNF-α炎癥因子均有顯著降低作用，體現(xiàn)了左金丸改善機(jī)體炎性微環(huán)境預(yù)防皮膚腫瘤的中醫(yī)整體觀，也隱含了皮膚腫瘤像其他腫瘤一樣的系統(tǒng)炎癥發(fā)病機(jī)制。

雖然腫瘤發(fā)生的機(jī)制尚不清楚，但皮膚組織上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和增殖是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)[13]。本研究結(jié)果表明，左金丸對(duì)皮膚組織上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和增殖均有顯著降低作用。結(jié)合左金丸不引起傳統(tǒng)化療藥物一樣的系統(tǒng)毒性，從安全性和經(jīng)濟(jì)成本上均比腫瘤化學(xué)防治藥有明顯優(yōu)勢(shì)，加之其既能使肝火清而自不橫逆犯胃、使胃火清的同時(shí)清降胃氣，體現(xiàn)了中藥治病“祛邪不忘保胃氣、調(diào)養(yǎng)之中護(hù)胃氣”的腫瘤防治思想[14]，有望成為一個(gè)防治腫瘤的物美價(jià)廉良藥。