邵錦 余進(jìn) 萬(wàn)喆 李若瑜 王愛(ài)平

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

曲霉在自然界無(wú)處不在，是環(huán)境中最常見(jiàn)的分離菌[1]。曲霉病最常見(jiàn)的致病曲霉有煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉等，煙曲霉在深部真菌感染中最多見(jiàn)[2]。近年來(lái)曲霉所致條件性感染發(fā)病率不斷上升，已成為僅次于念珠菌感染的深部真菌病[3]?，F(xiàn)報(bào)告1例肺真菌球術(shù)后組織病理通過(guò)免疫組化染色確診為肺曲霉球的病例。

1 臨床資料

患者男，43歲，因“咯血半月余”于2017年2月28日收入我院胸外科。患者半月前無(wú)明顯誘因出現(xiàn)咯血，整口鮮血，約十余口，無(wú)食物殘?jiān)?，無(wú)明顯咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困難及發(fā)熱。就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院胸片檢查發(fā)現(xiàn)左肺上葉占位，遂再行胸部CT檢查提示“左肺上葉片狀高密度影”(見(jiàn)圖1～2)。之后在我院行PET-CT檢查提示左肺上葉尖段結(jié)節(jié)影，輕度放射性攝取，考慮良性結(jié)節(jié)可能性大。以“左肺上葉占位”收入院?；颊甙l(fā)病以來(lái)，精神、睡眠、食欲可，二便正常，體重?zé)o明顯變化。否認(rèn)系統(tǒng)疾病史；否認(rèn)家族史。

體格檢查：一般情況良好，全身淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，心、肺、腹檢查未見(jiàn)明顯異常，全身皮膚未見(jiàn)異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、血沉、血生化、感篩4項(xiàng)及出凝血功能檢查未見(jiàn)明顯異常，腫瘤標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶44.2 ng/mL (正常<16.3 ng/mL)升高。痰找抗酸桿菌陰性，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性，支氣管分泌物真菌培養(yǎng)陰性，PPD試驗(yàn)及T-SPOT.TB試驗(yàn)陰性，G試驗(yàn)及GM試驗(yàn)陰性。胸部增強(qiáng)CT顯示左肺上葉尖后段可見(jiàn)不規(guī)則軟組織密度灶，增強(qiáng)掃描見(jiàn)邊緣少許強(qiáng)化，其內(nèi)可見(jiàn)新月形氣體密度。肺泡灌洗液超薄細(xì)胞涂片見(jiàn)纖毛柱狀上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞。因患者咯血明顯給予患者行左肺上葉切除術(shù)。術(shù)后組織病理顯示慢性支氣管炎，支氣管擴(kuò)張，腔內(nèi)可見(jiàn)真菌菌團(tuán)，HE、PAS及GMS染色陽(yáng)性，形態(tài)上傾向?yàn)榍?(見(jiàn)圖3～6)。免疫組化顯示炎細(xì)胞IgG+，IgG4散在+，Kappa+，Lambda++；肺泡上皮CK7+++；平滑肌細(xì)胞SMA+，Desmin+，HMB45-，S100-。最終診斷：肺真菌球，曲霉感染可能性大。出院后患者就診我科，再?gòu)?fù)查G試驗(yàn)及GM試驗(yàn)陰性，因患者的病灶已經(jīng)完全切除，未給予患者進(jìn)行系統(tǒng)抗真菌藥物治療。

2 實(shí)驗(yàn)研究

由于患者手術(shù)切除病變組織未進(jìn)行真菌培養(yǎng)，組織病理形態(tài)上傾向?yàn)榍?，因此，無(wú)法準(zhǔn)確確定病原菌。本研究對(duì)病變組織的蠟塊組織進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，尤其是免疫組化及 PCR，試圖將真菌鑒定到屬。本研究獲得患者知情同意。

2.1 真菌熒光染色

選擇4例非結(jié)核性分枝桿菌肉芽腫標(biāo)本作為陰性對(duì)照。使用防脫玻片，對(duì)患者及陰性對(duì)照蠟塊組織進(jìn)行石蠟切片，厚4 μm，常規(guī)烤片、脫蠟，去離子水洗，稍晾干。滴加真菌熒光染色液 (江蘇萊芙時(shí)代生物科技有限公司)覆蓋組織，染色1 min，傾去染液，去離子水稍洗，晾干。中性樹(shù)脂封片，平鋪通風(fēng)放置后在熒光顯微鏡下觀察。本研究標(biāo)本真菌熒光染色陽(yáng)性，熒光顯微鏡下可見(jiàn)真菌菌團(tuán)，亮藍(lán)色有隔菌絲，呈銳角分支，背景灰藍(lán) (見(jiàn)圖7)。4例非結(jié)核性分枝桿菌肉芽腫標(biāo)本染色均呈陰性結(jié)果。

2.2 免疫組化染色

選擇1例肺煙曲霉感染標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，1例少根根霉感染及1例不規(guī)則毛霉感染標(biāo)本作為陰性對(duì)照。常規(guī)石蠟切片、烤片、脫蠟，切片放入檸檬酸鈉溶液中，進(jìn)行水浴熱修復(fù)，室溫冷卻后PBS洗滌；滴加3%H2O2液封閉10 min，PBS洗滌；滴加1∶1 000稀釋的一抗置于4℃冰箱過(guò)夜，PBS洗滌，滴加二抗黃色增強(qiáng)液15 min，PBS洗滌；滴加二抗紅色試劑15 min，PBS洗滌；DAB顯色時(shí)，取切片置于顯微鏡下觀察，切片背景清晰，菌絲著色好，呈棕色時(shí)結(jié)束顯色，PBS洗滌，蘇木素復(fù)染，封片。一抗：兔抗曲霉多克隆抗體，對(duì)煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉特異，購(gòu)自美國(guó)RayBiotech公司。通用型二步法檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。本研究標(biāo)本及陽(yáng)性對(duì)照均為陽(yáng)性結(jié)果，顯微鏡下觀察本研究免疫組化染色結(jié)果，可見(jiàn)菌絲染成棕褐色，尤以細(xì)胞壁著色明顯，組織細(xì)胞核藍(lán)染，易與陽(yáng)性菌絲成分區(qū)分 (見(jiàn)圖8)。2例陰性對(duì)照均為陰性結(jié)果。

2.3 組織PCR

按照Qiagen石蠟包埋組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取蠟塊組織中DNA，分別使用真菌鑒定通用引物ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')、U1 (5'-GTGAAATTGTTGAAAGGGAA-3')和U2 (5'-GACTCCTTGGTCCGTGTT-3')于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增[3]。PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)中實(shí)驗(yàn)方法[4]。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。但瓊脂糖凝膠電泳未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。

3 討 論

慢性肺曲霉病 (CPA)是指由曲霉感染引起的一組感染性疾病，通常表現(xiàn)為長(zhǎng)期反復(fù)的咳嗽，呼吸困難和體重減輕，偶爾發(fā)生急性癥狀如咯血，支氣管或肺出血[5]。CPA最新指南指出慢性肺曲霉病根據(jù)臨床表現(xiàn)分為5類(lèi)：?jiǎn)伟l(fā)/單純曲霉球、曲霉結(jié)節(jié)、慢性空洞型肺曲霉病、慢性纖維化肺曲霉病和慢性壞死性/亞急性侵襲性肺曲霉病[6]。該患者為中年男性，主要癥狀為咯血，胸部增強(qiáng)CT顯示“左肺上葉尖后段不規(guī)則軟組織密度灶，其內(nèi)可見(jiàn)新月形氣體密度”，手術(shù)切除病灶后組織病理證實(shí)為肺真菌球，曲霉感染可能性大，免疫組化提示病原菌為曲霉屬，最終診斷為單純肺曲霉球。曲霉病指南 (2016)關(guān)于肺曲霉球的治療中指出，對(duì)于有癥狀的單純曲霉球患者，特別是有明顯咯血者，若沒(méi)有禁忌癥的話，應(yīng)該手術(shù)切除[7]。該患者因?yàn)榭┭凶蠓紊先~切除術(shù)。

圖1～2左肺上葉片狀高密度影 (箭頭處)圖3病理片示支氣管擴(kuò)張，腔內(nèi)可見(jiàn)真菌菌團(tuán) (箭頭處)圖4～6HE、PAS、GMS染色可見(jiàn)大量菌絲互相纏繞形成真菌菌團(tuán)×400圖7真菌熒光染色法可見(jiàn)亮藍(lán)色有隔菌絲，呈銳角分支 (箭頭處)圖8免疫組化染色可見(jiàn)菌絲染成棕褐色×400

Fig.1-2High density shadow on the superior lobe of left lung (arrow)Fig.3Histopathological sections showed bronchiectasis, fungal ball visible in the cavity (arrow)Fig.4-6HE, PAS, GMS showed a large number of hyphae forming fungal ball×400Fig.7Fungal fluorescence staining showed bright blue septate hyphae, with sharp-angle branch (arrow)×400Fig.8Immunohistochemical staining showed brown hyphae×400

目前對(duì)于曲霉感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)主要依靠組織真菌培養(yǎng)陽(yáng)性，通過(guò)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)進(jìn)行菌種鑒定，其中DNA測(cè)序技術(shù)可以幫助準(zhǔn)確鑒定菌種，但是DNA測(cè)序步驟相對(duì)復(fù)雜，大部分臨床實(shí)驗(yàn)室難以自行開(kāi)展?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS)是近年來(lái)新興的菌種鑒定技術(shù)，能快速鑒定病原微生物[8]。MALDI-TOF MS在真菌領(lǐng)域最先用于酵母菌鑒定，之后一些研究者進(jìn)行了絲狀真菌的研究，包括曲霉、皮膚癬菌、毛霉等，其在種水平的鑒定效果均較好[9-12]。尤其是曲霉鑒定，其準(zhǔn)確率可高達(dá)90%以上[13]。MALDI-TOF MS在臨床真菌鑒定方面具有較大的應(yīng)用前景。

以上的鑒定基于培養(yǎng)出的真菌，真菌培養(yǎng)過(guò)程較緩慢，需要幾天到幾周的時(shí)間。組織病理學(xué)方法可以早期快速地鑒定真菌感染。HE、PAS、GMS染色為真菌組織病理學(xué)常用的染色方法，通過(guò)顯示組織中的真菌成分來(lái)確定是否存在真菌感染。真菌熒光染色法在國(guó)內(nèi)是較新的染色方法，染色比較敏感。熒光染色液能夠與各類(lèi)真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)結(jié)合而發(fā)出熒光，可以清楚得顯示真菌菌絲、孢子及隔膜等成分。已有研究證實(shí)真菌熒光染色法在淺部真菌病標(biāo)本中陽(yáng)性檢出率明顯高于KOH濕片法[14]。無(wú)論是傳統(tǒng)的組織病理學(xué)染色還是真菌熒光染色，它們均為非特異性的染色方法，具有一定的局限性。一些致病真菌在組織中形態(tài)相似，僅依靠形態(tài)學(xué)很難鑒定。通過(guò)組織病理學(xué)染色找到曲霉的典型形態(tài)特征較困難，有時(shí)與毛霉、鐮刀菌、賽多孢霉等絲狀真菌難以區(qū)分。

免疫組化是根據(jù)真菌抗原性不同來(lái)鑒定組織中真菌的一項(xiàng)病理技術(shù)，可以提高真菌鑒定的特異性和病原學(xué)診斷水平。使用屬或種特異性抗體可以將某些真菌鑒定到屬或種。目前已有針對(duì)念珠菌屬、隱球菌屬、曲霉屬、毛霉目、孢子絲菌屬、馬爾尼菲籃狀菌的特異性抗體用于真菌鑒定的報(bào)道[15]。有研究表明使用兔抗曲霉多克隆抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)法識(shí)別組織中曲霉成分的敏感性高達(dá)88%，并且具有很高的特異性，與毛霉、念珠菌、暗色真菌以及其他透明絲孢霉沒(méi)有交叉反應(yīng)，可以準(zhǔn)確將其與其他絲狀真菌區(qū)分開(kāi)來(lái)[16]。本研究使用兔抗曲霉多克隆抗體，能夠特異性的識(shí)別肺組織的曲霉成分，陽(yáng)性菌絲成分被染為棕褐色，清楚直觀，幫助確定病原菌為曲霉屬。毛霉病標(biāo)本作為陰性對(duì)照其菌絲未著色，所以應(yīng)用該抗體進(jìn)行免疫組化可以區(qū)分曲霉與毛霉感染，可應(yīng)用于臨床病理懷疑曲霉感染的快速診斷。

組織PCR可以幫助鑒定蠟塊組織中真菌，但敏感性不高[17]。本研究中我們嘗試從蠟塊組織中提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然而瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)無(wú)條帶產(chǎn)生。分析原因可能與從福爾馬林固定石蠟包埋的組織中提取真菌DNA濃度低以及甲醛誘導(dǎo)的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)抑制長(zhǎng)片段DNA的擴(kuò)增有關(guān)。

綜上所述，真菌熒光染色可以幫助確定是否存在真菌感染，但不能確定真菌的種屬水平，組織PCR用于鑒定石蠟包埋組織中真菌的敏感性不高，而免疫組化技術(shù)用于真菌鑒定具有較高的敏感性和特異性。因此，當(dāng)病變組織缺少真菌培養(yǎng)結(jié)果時(shí)，免疫組化技術(shù)可以幫助快速確定菌屬，有助于臨床診療。鑒于本研究結(jié)果僅來(lái)自于一個(gè)病例，有待于今后積累更多的病例進(jìn)行驗(yàn)證。