李瑩瑩 崔東遙 常亞青 柳林 張寶警 姜惠婷 劉印 湛垚垚

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連 116023）

轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子 -β（Transforming growth factor，TGF-β）普遍存在于真核生物細胞中，是TGF-β超家族（Transforming growth factor superfamily）的重要成員之一。在哺乳動物中，TGF-β主要有TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3 三種不同的亞型［1］，在鳥類中存在 TGF-β4［2］，在兩棲類中存在 TGF-β5［3］。大量研究顯示，TGF-β信號通路在細胞增殖、分化、遷移、黏附、膠原產(chǎn)生、細胞外基質(zhì)合成和細胞凋亡等許多生命活動中均發(fā)揮重要作用［4-7］。截止到2018年5月，在美國國立生物信息中心（NCBI）中已登錄的TGF-β家族基因序列條目共有464條，其中鳥類220條，哺乳動物69條，棘皮動物43條，貝類21條，節(jié)肢動物19條，硬骨魚3條，兩棲類3條及其他物種86條。

相較于鳥類和哺乳動物而言，海洋生物TGF-β的研究仍相對較少，目前主要是關(guān)于魚類、貝類、棘皮類TGF-β基因的cDNA全長克隆、序列分析及生物功能的初步研究。例如，Ottaviani等［8］研究證實TGF-β1過表達可以誘導(dǎo)紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）血細胞的形狀變化和趨化遷移。之后，Kletsas等［9］在上述研究的基礎(chǔ)上通過免疫細胞化學(xué)方法證實TGF-β1信號可沿磷酸肌醇（Inositol phosphate）信號傳導(dǎo)途徑傳導(dǎo)，在紫貽貝體內(nèi)進行免疫調(diào)節(jié)。Maehr等［10］使用聚肌胞：聚胞苷酸［Polyinosinic-polycytidylic acid injection，Poly（I：C）］和脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）等刺激虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的頭腎（Head kidney，HK）巨噬細胞系，誘導(dǎo)其發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。與對照組相比，各免疫刺激劑處理組虹鱒巨噬細胞系中TGF-β1b基因的表達水平顯著升高（P＜0.05），提示，虹鱒TGF-β1b可能參與其主要的免疫過程。在棘皮動物中，TGF-β已被證實與海膽胚胎的對稱性生長，以及幼體骨骼的生物礦化（Biomineralization）密切相關(guān)［11-13］。

海水酸化（Seawater acidification or ocean acidification，OA）是由于海洋吸收了大氣中過量的CO2而導(dǎo)致的海水pH下降的現(xiàn)象［14-16］。大量研究證實，海水酸化對海洋生物和海洋生態(tài)系統(tǒng)有著深刻而復(fù)雜的影響［17］。海膽是海洋淺海生物的代表物種，也是研究海水酸化對海洋生物影響的模式生物之一［18］。研究發(fā)現(xiàn)，海水酸化不僅可以影響海膽骨骼的早期鈣化生長，還對不同海膽的受精、卵裂、對稱體制發(fā)育和浮游幼體存活等產(chǎn)生不同程度的影響［19-21］。胡婉彬［22］的研究顯示，與自然海水組相比，不同海水酸化條件下，馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）四腕浮游幼體中TGF-β基因的表達趨勢隨海水pH值的降低而顯著升高，且TGF-β信號通路始終位于顯著富集的差異表達信號通路的前10位，提示TGF-β基因可能在海膽浮游幼體響應(yīng)酸化海水脅迫中發(fā)揮重要作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，當生物體受到外界刺激或脅迫時，可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)TGF-β基因的相對表達量對外界環(huán)境刺激或脅迫作出響應(yīng)［23］。那么，TGF-β基因是否參與成體海膽響應(yīng)海水酸化脅迫的過程；不同海水酸化脅迫條件下，TGF-β基因在成體海膽中的表達模式是否發(fā)生變化，變化趨勢是否與浮游幼體相同；TGF-β基因在成體海膽響應(yīng)海水酸化中發(fā)揮何種功能，目前尚未見報道。

光棘球海膽（Mesocentrotus nudus），又稱大連紫海膽，主要分布于中國遼東半島和山東半島的黃、渤海海域，因其性腺營養(yǎng)豐富、品質(zhì)上乘，是我國北方近岸海域最主要的經(jīng)濟種類和重要的出口海產(chǎn)品種類之一［24］。為明確光棘球海膽（M.nudus）TGF-β基因的序列及結(jié)構(gòu)信息，初步探明該基因的表達模式和生物功能。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速擴增（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)首次獲得了光棘球海膽TGF-β基因（MnTGF-β）的cDNA全長序列，分析了該基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征，初步研究其在光棘球海膽中的組織表達規(guī)律及其在海水酸化脅迫下的表達變化情況，以期為豐富棘皮動物TGF-β家族成員序列信息以及生物功能研究提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所需的光棘球海膽（M. nudus），平均殼徑29.33 ± 2.80 mm，采集于大連黑石礁海域（121°33'47''E，38°51'55''N）。實驗前，暫養(yǎng)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室的循環(huán)水槽（約1 000 L）中，暫養(yǎng)條件為：pH 8.06± 0.01；鹽度30.16 ± 0.14；海水溫度12.56 ± 0.13℃；充分溶氧；暫養(yǎng)期間投喂海帶（Laminaria japonica），換水周期為2 d。

選擇健康、活力好的光棘球海膽3只，分別提取其性腺、體腔液、腸、圍口膜和管足5種組織，做好標記后立即用液氮冷凍，存放于-80℃中，用于MnTGF-β基因的克隆和組織表達規(guī)律檢測。

1.2 方法

1.2.1 海水酸化處理 海水酸化處理使用“實驗室模擬海水酸化系統(tǒng)”（ZL. 201320267332.7），CO2海水酸化脅迫按照文獻［20］中的方法進行。根據(jù)IPCC（2013）報告的預(yù)測2100年海洋pH值［25］，設(shè)定一個自然海水組（control）和3個海水酸化實驗組（OA1，△ pH = -0.3；OA2， △ pH = -0.4；OA3， △ pH =-0.5）。為減小實驗誤差，每組設(shè)置3個平行（n=3），共12組，每組中放入5只光棘球海膽。海水酸化處理過程中，使用pH計（HI9124，HANNA，意大利）和水質(zhì)儀（A329，Thermo，美國）實時監(jiān)測各組海水的pH、鹽度和溫度（表1）。為避免海水pH的劇烈波動，酸化脅迫期間不投喂食物。

分別在海水酸化脅迫的第1 d、4 d和7 d，從各實驗組中取出1只海膽，取其性腺、腸和管足3種組織，做好標記后立即用液氮冷凍，存放于-80℃中用于探究各組織中的MnTGF-β基因在不同酸化條件下的表達變化情況。

表1 實驗前后海水化學(xué)參數(shù)情況

1.2.2MnTGF-β基因cDNA全長的克隆 利用Trizol法提取光棘球海膽體腔液中的總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計（NanoPhotometer公司，德國）檢測RNA的完整性和濃度后，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（寶生物公司，大連）試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一條鏈cDNA（反應(yīng)體積及條件參照說明書進行）。根據(jù)紫球海膽（S.purpuratus）TGF-β2的 基 因 序 列（GenBank登 錄號：XP_793246.2）設(shè)計擴增光棘球海膽TGF-β基因核心片段的引物（表2）。使用LATaq試劑盒（寶生物公司，大連）進行PCR擴增，其PCR反應(yīng)體 系 為 ：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）4 μL， 上 下 游 引物（10 μmol/L）各 2 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 31 μL，TaKaRa LA Taq（5 U/μL）1 μL。反應(yīng)程序 ：94℃ 預(yù)變性 5 min ；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過膠回收試劑盒（生工，上海）回收目的片段，并連接到pEASY-T1質(zhì)粒，后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中（全式金，北京），涂LB（含Amp）平板后37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。翌日挑取單菌落接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基（Amp終濃度為100 μg/mL）中振蕩培養(yǎng)，通過菌落PCR使用M13通用引物（表2）初步鑒定陽性克隆，后送至上海生物生工公司進行測序。將測序結(jié)果于NCBI中進行比對，獲得MnTGF-β基因的保守區(qū)序列，再以該序列作為模板進行RACE片段擴增，設(shè)計5'/3'RACE特異性外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物（表2）。5'/3'RACE反轉(zhuǎn)錄按照SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒（Clontech公司，美國）說明書進行，獲得RACE的cDNA模板。以RACE cDNA為模板進行5'/3' PCR產(chǎn)物擴增，其反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、產(chǎn)物純化、克隆及序列測定方法同上述核心片段的克隆。所用引物（除通用引物）均使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計。

表2 用于MnTGF-β基因cDNA RACE和實時定量PCR的引物序列

1.2.3MnTGF-β基因序列的生物信息學(xué)分析 使用BLAST（BLASTX，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行MnTGF-β的核苷酸和氨基酸序列相似性分析；使用 ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）確定MnTGF-β開放閱讀框（Open reading frame，ORF）及其編碼的氨基酸序列；使用ExPasy（http：//www.expasy.org/）的Protparam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析推導(dǎo)MnTGF-β蛋白的基本理化性質(zhì)；使用SMART網(wǎng)絡(luò)工具（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進行MnTGF-β蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測；使 用 PSIPRED v3.3（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和 PHD（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_phd.html） 預(yù)測MnTGF-β蛋白二級結(jié)構(gòu)；采用同源建模法，利用 Swiss-model（https：//swissmodel.expasy.org/） 預(yù)測MnTGF-β蛋白的三級結(jié)構(gòu)，然后使用Swiss-Pdb Viewer4.1軟件進行可視化圖形分析；使用MEGA 7.0和Genedoc 2.6軟件進行TGF-β多重序列比對，在此基礎(chǔ)上，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）的系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 qRT-PCR驗證基因表達分析 采用Trizol法提取各組織的總RNA，檢測其RNA的完整性和濃度后，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with a gDNA Eraser試劑盒（寶生物公司，大連）去除總RNA中的殘余的基因組DNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（反應(yīng)體積及條件參照說明書進行）。為了減小實驗誤差，分別將3個平行樣的RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，所有cDNA稀釋10倍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

使用 Applied Biosystems 7500（Life technologies，美國）進行qRT-PCR以分析MnTGF-β基因的表達情況。選取18s基因為內(nèi)參基因［26］，在qRT-PCR分析中使用的引物列于表2中。為避免實驗誤差，每組設(shè)置3個平行（n=3）。在總體積20 μL的體系中包括2 μL cDNA，10 μL 2×SYBR Green Master mix，0.4 μL ROX Reference Ⅱ，6 μL ddH2O 和 0.8 μL 上、下游引物（10 μmol/L）。反應(yīng)程序為：95℃30 s；95℃5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_量的計算采用2-ΔΔCt方法進行分析［27］，其公式為：

-ΔΔCt=［Ct（sample）- Ct（reference）］-［Ct（control）- Ct（reference）］

DEDS的仿真模型主要有面向事件、面向活動和面向進程3種，它們各有不同特點，我們可根據(jù)不同需要選擇合適的仿真模型。仿真模型實現(xiàn)的有效方法之一是建立仿真函數(shù)庫。它的優(yōu)點在于建模者可以專注于模型的邏輯關(guān)系而不必擔(dān)心模型實現(xiàn)的細節(jié)，因此，仿真函數(shù)庫的建立需要足夠靈活，以保證其適用于各類系統(tǒng)的建模。它的基本功能模塊包括：隨機數(shù)生成、實體建模、運行調(diào)度、隊列建模、仿真結(jié)果收集和分析。仿真函數(shù)庫首先應(yīng)有調(diào)用子程序或函數(shù)的能力，并且是通過參數(shù)傳遞來實現(xiàn)。其次，要有實時生成動態(tài)數(shù)據(jù)對象的能力和能夠支持應(yīng)用預(yù)編譯模塊構(gòu)成的庫[4]。

2 結(jié)果

2.1 MnTGF-β基因全長cDNA序列及分析

利用RACE技術(shù)首次獲得光棘球海膽的TGF-β基因的cDNA序列（GenBank登錄號：MH178665）全長2 299 bp，開放閱讀框長度為1 290 bp，編碼430個氨基酸；5'非編碼區(qū)（5'untranslated regions，5'UTR）長度為745 bp，3'非編碼區(qū)（3'untranslated regions，3'UTR）長度為261 bp，并含有一個典型的不穩(wěn)定因素結(jié)構(gòu)ATTTA；起始密碼子（ATG）位于序列的第746 bp處，終止密碼子（TAG）位于序列的第2 036 bp處；經(jīng)生物信息分析發(fā)現(xiàn)，MnTGF-β蛋白的理論分子量為48.31 kD，理論等電點為5.84，一個典型的TGF-β超家族結(jié)構(gòu)域位于MnTGF-β蛋白的Ser318-Ser430區(qū)域（圖1）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，MnTGF-β蛋白共包含16.28%的α-螺旋（helix）、26.74%的延伸鏈（strand）和56.98%的無規(guī)則卷曲（coil）（圖2）；以已知三維結(jié)構(gòu)的人的TGF-β1（Swiss-model模板號：5vqf.2.A）為模板，進行同源建模預(yù)測得到MnTGF-β的氨基酸序列與人TGF-β1氨基酸序列的一致性為33.62%，兩者均具有“半胱氨酸結(jié)（Cysteine knot）”結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.2 同源性比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

多重序列比對結(jié)果（圖4）顯示，MnTGF-β蛋白與紫球海膽（S. purpuratus）TGF-β2蛋白序列（NCBI登錄號：XP_793246.2）的同源性最高，達到97.69%；與仿刺參（Apostichopus japonicas）TGF-β2（NCBI登錄號：PIK61515.1）、大海馬（Hippocampus kuda）TGF-β1（NCBI登錄號 ：ADK92394.1）、斑馬魚（Danio rerio）TGF-β1（NCBI登錄號：NP_8782-93.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）TGF-β1（NCBI登錄號：NP_001081330.1）、小鼠（Mus musculus）TGF-β1（NCBI登 錄 號 ：NP_035707.1） 的 同 源 性 為21.20% 和人（Homo sapiens）TGF-β1（NCBI登錄號：AAP36538.1）的同源性為30%。

由圖5可以看出，利用MEGA7.0軟件的鄰接法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中顯示，11種生物的 TGF-β的 3個亞型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）（表3）各自聚為一支。其中，光棘球海膽（M. nudus）的MnTGF-β氨基酸序列與紫球海膽（S.purpuratus）的 TGF-β2 和仿刺參（A. japonicas）的TGF-β2聚為一支，其與紫球海膽TGF-β2的氨基酸序列親緣關(guān)系最近。

表3 光棘球海膽MnTGF-β氨基酸序列多重比對和系統(tǒng)進化樹所用物種信息

2.3 MnTGF-β基因的組織表達情況

如圖6所示，MnTGF-β基因在光棘球海膽性腺（Gonad）、體腔液（Coelomic fluid）、腸（Intestines）、圍口膜（Peritomial membrane）和管足（Tube foot）5種組織中均有表達，且呈現(xiàn)一定的組織特異性。MnTGF-β基因在檢測組織中的相對表達量從高到低依次為：管足＞圍口膜＞腸＞體腔液＞性腺。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，MnTGF-β基因在光棘球海膽管足組織中的相對表達量最高且極顯著高于在性腺、體腔液、腸和圍口膜4種組織中（P＜0.01），而MnTGF-β基因在光棘球海膽性腺、體腔液和腸中的相對表達量并無顯著差異。值得注意的是，MnTGF-β基因在光棘球海膽性腺組織中的相對表達量最低，分別為管足的1.14%和圍口膜的1.53%。

2.4 不同海水酸化脅迫下光棘球海膽MnTGF-β基因的組織表達

性腺不僅是海膽的繁殖器官更是最重要的經(jīng)濟產(chǎn)品，腸是海膽的主要消化器官，管足是海膽的運動及觸覺器官，為進一步明確MnTGF-β基因在成體海膽應(yīng)答海水酸化脅迫中的表達規(guī)律及生物學(xué)功能，本研究以光棘球海膽的性腺、腸和管足組織為對象，探究不同海水酸化條件下成體光棘球海膽MnTGF-β基因的表達變化情況。

圖1 MnTGF-β基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

如圖7所示，酸化脅迫1 d后，OA1組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因的相對表達量相較于自然海水組（control）略有升高，但不具有顯著性差異；OA2組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因的相對表達量與自然海水組相比則呈極顯著降低趨勢（P＜0.01）；OA3組性腺組織的MnTGF-β基因的相對表達量雖略高于OA2組，但是與自然海水組相比仍然呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；酸化脅迫4 d后，相較于自然海水組而言，OA1、OA2和OA3組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因的相對表達量均呈現(xiàn)極顯著下調(diào)趨勢（P＜0.01）；酸化脅迫7 d后，OA1組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因相較于自然海水組呈現(xiàn)極顯著上調(diào)趨勢（P＜0.01），而OA2組和OA3組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因的相對表達量與自然海水組相比均無顯著性差異。

圖2 MnTGF-β蛋白的TGF-β超家族結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)

由圖8可以看出，與自然海水組相比，酸化脅迫1 d和4 d時，OA1、OA2和OA3組光棘球海膽腸組織中MnTGF-β基因的相對表達量均極顯著下調(diào)（P＜0.01）。而酸化脅迫7 d時，OA1組光棘球海膽腸組織中MnTGF-β基因的相對表達量與自然海水組相比呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢（P＜0.05），OA2和OA3組光棘球海膽腸組織中MnTGF-β基因與自然海水組相比依然呈現(xiàn)極顯著下調(diào)趨勢（P＜0.01）。

圖3 光棘球海膽MnTGF-β蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

本實驗利用同源克隆和RACE技術(shù)首次獲得光棘球海膽的TGF-β基因全長cDNA序列，經(jīng)生物信息分析得知，該序列編碼430個氨基酸，與紫球海膽（S. purpuratus）SpTGF-β2的同源性較高，達到97.69%，但相比SpTGF-β2氨基酸序列少了2個氨基酸，這一結(jié)果提示，MnTGF-β和SpTGF-β2在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)上可能會有所不同。值得注意的是，MnTGF-β氨基酸序列與同為棘皮動物的仿刺參（A. japonicus）AjTGF-β2的同源性僅為24.88%，分析其原因可能是在分子進化過程中，光棘球海膽的MnTGF-β和仿刺參的AjTGF-β2分別起源于TGF-β家族的不同亞基。二級結(jié)構(gòu)分析顯示，與紫海膽SpTGF-β2的二級結(jié)構(gòu)相比，兩者均具有超過50%的無規(guī)則卷曲（coil），其中，MnTGF-β蛋白的二級結(jié)構(gòu)的中α-螺旋（helix）含量較少而延伸鏈（strand）的含量較高，這可能是由于MnTGF-β相較于SpTGF-β2的氨基酸序列少了2個氨基酸造成的。同源建模預(yù)測MnTGF-β蛋白三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與人的TGF-β1蛋白相比，MnTGF-β蛋白的C末端也具有半胱氨酸組成的典型的“半胱氨酸結(jié)（Cysteine knot）”結(jié)構(gòu)。在光棘球海膽的“半胱氨酸結(jié)”結(jié)構(gòu)中，8個半胱氨酸以成對的方式形成分子中心區(qū)的4對鏈內(nèi)二硫鍵，結(jié)合第9個半胱氨酸形成鏈間二硫鍵一起形成TGF-β二聚體，提示，光棘球海膽的MnTGF-β可能與大海馬的TGF-β1起源于同一祖先［28］。多重序列比對結(jié)果顯示，8種生物的TGF-β超家族結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性，均具有特征性標志成熟肽起始的KEX-Furin樣蛋白酶識別位點（RKRR）［29-30］和整合素結(jié)合位點（RGD）［31］。值得注意的是，光棘球海膽中的KEX-Furin樣蛋白酶識別位點由RRRR取代了RKRR（粗體為差異氨基酸）。系統(tǒng)進化分析顯示，光棘球海膽與紫球海膽（S.purpuratus）聚為最近的一支，說明海膽的TGF-β在進化過程中高度保守，這一關(guān)系也符合光棘球海膽的進化和分類地位。

本實驗采用實時熒光定量PCR技術(shù)，選取光棘球海膽性腺、體腔液、腸、圍口膜和管足等5個組織，測定了MnTGF-β基因在各組織中的相對表達量。實驗結(jié)果表明，MnTGF-β基因在光棘球海膽管足組織中的相對表達量最高；其次為圍口膜、腸和體腔液，而在性腺組織中的相對表達量最低，這說明光棘球海膽MnTGF-β基因的相對表達具有鮮明的組織特異性（P＜0.01）。

圖4 光棘球海膽與其他7種生物TGF-β蛋白序列的多重比對

圖5 11種生物TGF-β蛋白的系統(tǒng)進化分析

圖6 MnTGF-β基因在光棘球海膽不同組織中的相對表達情況

圖7 不同酸化條件下MnTGF-β在光棘球海膽性腺組織中的相對表達情況

圖8 不同酸化條件下MnTGF-β在光棘球海膽腸組織中的相對表達情況

圖9 不同酸化條件下MnTGF-β在光棘球海膽管足組織中的相對表達情況

有研究顯示，海水酸化不僅對海洋生物的早期發(fā)育有顯著影響，而且對海洋生物成體的生理生化過程也具有深刻而復(fù)雜的影響。本研究結(jié)果顯示，與自然海水組相比，在不同海水酸化脅迫下，光棘球海膽性腺、腸和管足這3種重要器官中MnTGF-β基因的相對表達變化規(guī)律各不相同，說明海膽的TGF-β基因在應(yīng)答海水酸化脅迫時具有一定的組織特異性。Dupont等［32］報道，海水酸化脅迫綠海膽（Strongylocentrotus droebachiensis）4個月后，通過計算產(chǎn)卵數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，酸化處理組的綠海膽的繁殖力降低了4.5倍，提示海水酸化對綠海膽性腺的發(fā)育和成熟具有負面效應(yīng)。Kurihara等［33］對馬糞海膽（H. pulcherrimus）酸化脅迫9個月后發(fā)現(xiàn)，海水酸化可延遲馬糞海膽的性腺發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，與自然海水組相比，海水酸化脅迫4 d時，各海水酸化脅迫組光棘球海膽性腺中MnTGF-β基因的相對表達均受到顯著抑制，而海水酸化脅迫7 d時，各海水酸化脅迫組光棘球海膽性腺中MnTGF-β基因的相對表達量略有回升，其中，OA1組光棘球海膽性腺中MnTGF-β基因的相對表達量極顯著高于自然海水組（P＜0.01）。分析這一結(jié)果產(chǎn)生的原因是：本研究取樣正值光棘球海膽繁殖前期，其性腺發(fā)育相關(guān)基因正處于活躍狀態(tài)，與性腺發(fā)育密切相關(guān)的MnTGF-β基因?qū)Σ煌Ｋ峄瘲l件的響應(yīng)結(jié)果提示，急性海水酸化脅迫可能會抑制光棘球海膽的性腺發(fā)育。但是，隨著酸化脅迫時間的增長，光棘球海膽可能通過顯著地上調(diào)表達MnTGF-β基因來補償海水酸化對性腺發(fā)育的延滯作用，使得光棘球海膽的性腺得以正常發(fā)育，然而更為深入的機制仍需進一步的研究和探索。Heuer等［34］研究表明，酸化環(huán)境會誘發(fā)海灣蟾蜍魚（Opsanus beta）發(fā)生酸中毒，由于對酸中毒的補償作用，引起了腸道陰離子交換的增加，對腸組織造成更大的損傷。Hu等［35］研究發(fā)現(xiàn)大西洋鱈魚（Gadus morhua）在二氧化碳較高水平的環(huán)境下，其腸組織上皮中的大多數(shù)陰離子轉(zhuǎn)運蛋白表達上調(diào)，表明海水酸化可增加大西洋鱈魚腸組織陰離子的分泌速率進而對其腸組織造成損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與自然海水組相比，當海水pH降低0.3個單位時，光棘球海膽腸組織MnTGF-β基因的相對表達量隨著酸化時間延長呈現(xiàn)極顯著降低而后顯著升高的趨勢，且在酸化脅迫的第7天顯著高于自然海水組（P＜0.05）；當海水pH降低0.4和0.5個單位時，光棘球海膽腸組織MnTGF-β基因的相對表達量均極顯著低于自然海水組（P＜0.01）。Monteleone等［36］在人類腸炎?。↖nflammatory bowel diseases，IBD）的研究中指出，TGF-β是一種具有能夠提高黏膜修復(fù)能力的上皮細胞因子，在機體損傷后能促進上皮黏膜的修復(fù)。推斷本研究結(jié)果中，不同酸化條件下光棘球海膽MnTGF-β基因在其腸道中的不同表達趨勢，可能是由于海水酸化破壞了光棘球海膽的腸道黏膜，MnTGF-β基因可能參與光棘球海膽腸道黏膜修復(fù)等過程。當海水酸化程度較輕時（△pH≥-0.3），光棘球海膽可通過上調(diào)腸組織中MnTGF-β基因的相對表達進行適應(yīng)和修復(fù)；而當海水酸化程度不斷加深時（△pH≤-0.4）、腸組織中MnTGF-β基因的相對表達受到嚴重抑制。而對于海水酸化造成的腸組織損傷，光棘球海膽可能通過其他途徑進行修復(fù)，但其具體的機制仍需進一步深入研究。管足不僅是海膽的感覺、運動和依附器官，也是海膽感知外界環(huán)境變化或刺激并作出快速反應(yīng)的重要防御器官［37］。目前，尚未有研究報道海膽管足中TGF-β基因在應(yīng)對環(huán)境脅迫過程中的作用。本研究結(jié)果顯示，海水酸化脅迫下，光棘球海膽管足中MnTGF-β基因的相對表達量隨著酸化時間的延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。而當海水pH降低0.3和0.4個單位時，在光棘球海膽管足中的MnTGF-β基因則在酸化脅迫的第7天出現(xiàn)極顯著的上調(diào)表達（P＜0.01）。推測，在酸化脅迫下，管足通過提高其TGF-β基因的相對表達量以響應(yīng)外界環(huán)境的變化或刺激，進而發(fā)揮防御作用。

4 結(jié)論

本實驗首次獲得光棘球海膽的TGF-β基因全長cDNA序列，并對其序列特征進行了較為全面的生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光棘球海膽MnTGF-β與紫球海膽SpTGF-β2的親緣關(guān)系最近，與仿刺參AjTGF-β2可能起源于TGF-β家族的不同亞基?；虮磉_譜檢測發(fā)現(xiàn)，光棘球海膽MnTGF-β基因的相對表達具有鮮明的組織特異性。不同海水酸化脅迫條件下，光棘球海膽不同組織中MnTGF-β基因的表達變化規(guī)律各不相同，呈現(xiàn)一定的組織特異性，說明光棘球海膽MnTGF-β基因在光棘球海膽響應(yīng)海水酸化中發(fā)揮重要作用，但其具體機制仍需進一步的研究和探索。