喬晶 崔晟榕 石宏武 羅祖良 馬小軍

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

環(huán)阿屯醇（Cycloartenol）廣泛分布于植物中，是重要的藥效物質(zhì)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它具有明顯的抗炎［1-2］、抗氧化［3］、抗腫瘤［4-5］、調(diào)節(jié)膽固醇［6］等藥理活性。此外，它還是重要的藥物中間體和先導(dǎo)化合物，是植物甾醇、甾體皂苷等化合物半化學(xué)合成及生物合成的關(guān)鍵底物。環(huán)阿屯醇合酶（Cycloartenol Synthase，簡(jiǎn)稱CAS）作為合成環(huán)阿屯醇的關(guān)鍵調(diào)控基因，也是很多植物甾醇及甾體類物質(zhì)生物合成途徑中的重要環(huán)化酶［7］。目前，已有20多種植物的CAS基因被分離和克隆出來(lái)，如擬南芥［8］（Arabidopsis thaliana）、盾葉薯蕷［9］（Dioscorea zingiberensis）、光果甘草［10］（Glycyrrhiza glabra）、黃芪［11］（Astragalus membranaceus）、 丹 參［12］（Salvia miltiorrhiza）和刺五加［13］（Eleutherococcus senticosus）等，并通過(guò)異源表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證。在生物體內(nèi)，三萜類物質(zhì)和植物甾醇均通過(guò)異戊二烯途徑合成，且都源于同一前體物質(zhì)—2，3-氧化鯊烯［14］。Liang等［15］研究表明，CAS可與β-AS競(jìng)爭(zhēng)2，3-氧化鯊烯，對(duì)CAS基因的表達(dá)進(jìn)行抑制后，減少了植物甾醇合成，使2，3-氧化鯊烯更多的進(jìn)入到三萜皂苷代謝支流，從而間接提高了三萜皂苷的產(chǎn)量，說(shuō)明CAS不僅是植物甾醇合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，同時(shí)又是三萜物質(zhì)合成的重要調(diào)控位點(diǎn)。雖然目前已在CAS基因的分離、純化、克隆及表達(dá)分析上取得了一定的進(jìn)展，但是對(duì)于CAS的酶結(jié)構(gòu)以及催化2，3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化的機(jī)理尚不清楚。因此，該酶性質(zhì)及催化機(jī)理的研究對(duì)次生代謝調(diào)控具有重要意義。

CAS屬于氧化鯊烯環(huán)化酶（OSCs）大家族的成員之一，OSC催化的環(huán)化作用是以2，3-氧化鯊烯為底物經(jīng)過(guò)一系列的質(zhì)子化、環(huán)化、重排和去質(zhì)子化作用完成的。然而，由于OSCs分子結(jié)構(gòu)較大且屬于膜蛋白，晶體結(jié)構(gòu)獲得困難［16］，目前，只有來(lái)自人、牛和酵母的羊毛甾醇合酶被純化獲得晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)三維晶體結(jié)構(gòu)研究催化機(jī)理及活性位點(diǎn)的工作無(wú)法開(kāi)展［17］，從而阻礙了酶進(jìn)一步的改進(jìn)及應(yīng)用。同源模建是根據(jù)模板蛋白，預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。對(duì)于尚未或者無(wú)法獲得實(shí)驗(yàn)晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，同源模建無(wú)疑是一種重要而有效的輔助手段。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者以已解析的晶體結(jié)構(gòu)為模板，結(jié)合生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等開(kāi)展OSCs催化活性的研究，以深入理解OSCs的催化環(huán)化/重排反應(yīng)機(jī)理，產(chǎn)物多樣性以及活性功能氨基酸殘基。

綜上所述，CAS反應(yīng)機(jī)制的研究是近年來(lái)一個(gè)極富挑戰(zhàn)性的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，揭示其催化的活性位點(diǎn)及環(huán)化的機(jī)制，具有重要的理論意義。同時(shí)該酶能競(jìng)爭(zhēng)三萜合成的共同底物2，3-氧化鯊烯，實(shí)現(xiàn)對(duì)次級(jí)代謝支路的調(diào)控，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。本研究以羅漢果CAS為對(duì)象開(kāi)展研究，通過(guò)分析序列，采用同源建模及分子模擬的軟件模擬預(yù)測(cè)CAS三維結(jié)構(gòu)和活性中心，以及其催化底物2，3-氧化鯊烯的環(huán)化的機(jī)制，旨為酶的改造及其代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 同源建模序列來(lái)源及模板選擇 CAS氨基酸序列為本實(shí)驗(yàn)室前期研究所獲得［18］，已登錄于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，基因登錄號(hào)為HQ128566?；贑AS氨基酸序列，利用Blast程序在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein data bank，PDB）中搜尋與其氨基酸序列一致性大于或等于30%的X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)用于三維結(jié)構(gòu)的建模。

1.1.2 受體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 上文同源建模得到的CAS酶結(jié)構(gòu)用于下面的分子對(duì)接。初始結(jié)構(gòu)用AutoDockTools 1.5.6進(jìn)行處理，保存蛋白原有電荷，并生成pdbqt文件用于對(duì)接。

1.1.3 配體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 小分子配體2，3-氧化鯊烯以及碳正離子中間體的三維結(jié)構(gòu)如圖1所示。使用MOPAC程序優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)并計(jì)算AM1原子電荷用于后續(xù)的分子對(duì)接，然后用AutoDock Tools 1.5.6處理配體結(jié)構(gòu)，處理后生成相應(yīng)的pdbqt文件用于對(duì)接。

1.2 方法

1.2.1 同源建模 根據(jù)獲取的模板蛋白三維結(jié)構(gòu)文件以及序列比對(duì)文件，根據(jù)序列的相似性推測(cè)結(jié)構(gòu)的相似性，使用Modeller 9.17對(duì)CAS進(jìn)行同源模建，從而獲取目標(biāo)蛋白CAS的三維結(jié)構(gòu)。所有計(jì)算均在MolDesigner分子模擬平臺(tái)（MolDesigner Molecular Simulation Platform）上完成。

圖1 2，3-氧化鯊烯以及碳正離子中間體的分子結(jié)構(gòu)

1.2.2 模型評(píng)價(jià) 本文分別用PROCHECK和Verify-3D程序?qū)?yōu)化后模型蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。Ramachandran plot用于闡述蛋白質(zhì)或肽立體結(jié)構(gòu)中肽鍵內(nèi)α碳原子和羰基碳原子間的鍵的旋轉(zhuǎn)度對(duì)α碳原子和氮原子間鍵的旋轉(zhuǎn)度，主要用來(lái)指明蛋白質(zhì)或肽類中氨基酸殘基的允許和不允許的構(gòu)象。Ramachandran plot主要分為三個(gè)區(qū)域，允許區(qū)（紅色區(qū)域），最大允許區(qū)（黃色區(qū)域），不允許區(qū)（空白區(qū)域）。

1.2.3 分子對(duì)接 分子對(duì)接采用AutoDock 4.2.6程序?qū)崿F(xiàn)。首先確定配體對(duì)接位點(diǎn)，對(duì)接口袋中心點(diǎn)坐標(biāo)為（26.264，70.645，14.631），網(wǎng)格數(shù)目分別為40×60×50，格點(diǎn)間距為 0.375 埃（?ngstr?m，符號(hào)?），對(duì)接口袋區(qū)域的格點(diǎn)能量采用AutoGrid程序進(jìn)行計(jì)算。對(duì)接時(shí)，構(gòu)象搜索策略采用拉馬克遺傳 算 法（Lamarckian Genetic Algorithm，LGA）， 關(guān)鍵參數(shù)如下：對(duì)接次數(shù)（Number of GA Runs）設(shè)置為100，種群數(shù)目（Population Size）設(shè)置為150，最大迭代次數(shù)（Maximum Number of evaluations）設(shè)置為25 000 000，其余參數(shù)采用默認(rèn)值。所有計(jì)算均在MolDesigner分子模擬平臺(tái)（MolDesigner Molecular Simulation Platform）上完成。

2 結(jié)果

2.1 同源建模

2.1.1 模板選擇 通過(guò)在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋發(fā)現(xiàn)，在下載的OSCs氨基酸序列中，僅人的羊毛甾醇合酶1W6J和1W6K能獲得一致性大于或等于30% 的晶體模板，也僅這2個(gè)蛋白可以進(jìn)行同源建模。圖2為CAS和2個(gè)模板的序列比對(duì)結(jié)果，模板覆蓋率為86%，序列一致性為49%。

圖2 CAS與模板1W6J、1W6K的序列比對(duì)

2.1.2 模型評(píng)價(jià) CAS模型的Ramachandran plot顯示模型中的氨基酸殘基如圖3所示，90.8%的氨基酸位于允許區(qū)，8.7%的氨基酸殘基位于最大允許區(qū)域，只有0.5%的氨基酸殘基位于扭轉(zhuǎn)角的禁止區(qū)域。模型中99.5%的蛋白質(zhì)殘基的二面角都在合理的范圍之內(nèi)，符合立體化學(xué)能量規(guī)則。

圖3 模建CAS酶的Ramachandran plot

Verify-3D是UCLA的David Eisenberg教授開(kāi)發(fā)的一種基于“穿線”法的模型評(píng)價(jià)程序。該方法采用3D-1D的打分函數(shù)來(lái)檢測(cè)所構(gòu)建模型與自身氨基酸序列的匹配度關(guān)系。80%殘基的Verify score大于0.2即認(rèn)為模型合理。Verify-3D圖顯示了序列中每個(gè)氨基酸的打分。從圖4可知，CAS結(jié)構(gòu)中的92.34%氨基酸殘基在Verify-3D中Verify score平均值大于0.2，模型通過(guò)了Verify 3D檢測(cè)，表明所建模型質(zhì)量較好。

2.1.3 酶結(jié)構(gòu)分析 為進(jìn)一步討論建模所得模型的合理性和分析CAS的催化活性中心結(jié)構(gòu)，本文對(duì)1W6J晶體蛋白結(jié)構(gòu)與CAS模型進(jìn)行了疊合對(duì)比。通過(guò)CAS模型與1W6J晶體結(jié)構(gòu)的疊合對(duì)比分析可得（圖5），CAS酶模型與晶體蛋白間的RMSD為0.246 ?，CAS能夠與晶體模板很好重合。晶體模板上的催化中心主要由Asp455、Cys456、Cys533、Tyr503、His232關(guān)鍵殘基構(gòu)成。通過(guò)疊合對(duì)比，CAS酶上的Asp491、Cys492、Cys570、Tyr540、His265殘 基 與晶體模板的關(guān)鍵殘基相互重合。

圖4 CAS的Verify-3D圖

2.2 分子對(duì)接結(jié)果

對(duì)接結(jié)果表明2，3-氧化鯊烯分子能夠結(jié)合到CAS酶的活性空腔，結(jié)合自由能為-11.15 kcal/mol。為進(jìn)一步探索CAS酶對(duì)2，3-氧化鯊烯的催化機(jī)制，我們對(duì)CAS酶和2，3-氧化鯊烯的相互作用進(jìn)行了分析。如圖6-A、C所示，2，3-氧化鯊烯上的環(huán)氧與CAS酶的Asp491羧酸氫原子可形成一個(gè)氫鍵，鍵長(zhǎng)為1.8 ?，該氫鍵引發(fā)后續(xù)的環(huán)化反應(yīng)。2，3-氧化鯊烯的疏水鏈與CAS酶結(jié)合空腔中的His265、Pro375、Val376、Phe480、Phe734殘基間可形成疏水作用，疏水作用可進(jìn)一步加強(qiáng)配體與CAS的結(jié)合，有利于反應(yīng)物2，3-氧化鯊烯穩(wěn)定結(jié)合在酶的活性空腔中。

在CAS酶催化2，3-氧化鯊烯過(guò)程中，C27和C11間會(huì)形成單鍵，進(jìn)而生成產(chǎn)物環(huán)阿屯醇。據(jù)此我們推測(cè)，原本環(huán)化后的C27碳正離子中間體，經(jīng)過(guò)碳正離子遷移后形成C11位的碳正離子中間體（如圖6-B所示），而C27位上的氫被結(jié)合位點(diǎn)附近的殘基奪走，進(jìn)而C27、C11形成單鍵。在2，3-氧化鯊烯與CAS酶催化位點(diǎn)的對(duì)接結(jié)構(gòu)中，2，3-氧化鯊烯能夠進(jìn)入到催化位點(diǎn)，且Tyr540的羥基氧原子與C27位上的氫原子間距離為3.1 ?（如圖6-C紅色虛線所示），表明Tyr540可能具有接收C27上的氫質(zhì)子進(jìn)而催化C27、C11成鍵的作用。

圖5 模建CAS酶與晶體蛋白1W6J的疊合圖示

圖6 小分子與CAS酶的相互作用分析

碳正離子中間體與CAS酶的結(jié)合構(gòu)象中，中間體C27原子（如圖6-D所示，C27顯示為藍(lán)紫色球型）上的一個(gè)氫原子與Tyr540的羥基氧原子的距離為2.5 ?（如圖6-D紅色虛線所示），該距離比反應(yīng)物體系中的距離明顯減小，表明去質(zhì)子化的Tyr540羥基氧原子可能奪取C27上的氫原子，使得C27與C11間形成單鍵生成產(chǎn)物環(huán)阿屯醇。

另外，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CAS酶活性空腔內(nèi)的Tyr540殘基上的羥基氫原子能夠與His265的氮原子形成氫鍵。說(shuō)明在催化過(guò)程中，Tyr540羥基上的氫原子可能轉(zhuǎn)移到His265的氮原子上，去質(zhì)子化的Tyr540作為氫質(zhì)子受體接受2，3-氧化鯊烯甲基上的氫原子，從而導(dǎo)致2，3-氧化鯊烯被催化為環(huán)阿屯醇。

2.3 催化機(jī)制推測(cè)

根據(jù)上述對(duì)接結(jié)果，本文推測(cè)CAS酶對(duì)2，3-氧化鯊烯的催化機(jī)理主要分三步完成（圖7）：（1）Cys492和Cys570殘基向Asp491提供氫質(zhì)子，2，3-氧化鯊烯上的環(huán)氧基奪取Asp491上的氫質(zhì)子后斷裂，由于碳正離子-π電子作用（cationic-π interaction）引起四個(gè)環(huán)的環(huán)化反應(yīng)形成C27正離子中間體；（2）C27正離子中間體經(jīng)過(guò)一系列碳正離子重排，形成C11正離子中間體；（3）Tyr540殘基上的羥基氫原子能夠與His265的氮原子形成氫鍵，被去質(zhì)子化的Tyr540奪取C27上的氫質(zhì)子，進(jìn)而C27與C11原子形成單鍵生成環(huán)阿屯醇。

3 討論

研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是了解蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能的重要途徑。氨基酸序列對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象起著決定性的作用，很多同源性的氨基酸序列就可以決定同一蛋白構(gòu)象，這是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的理論基礎(chǔ)［19］。目前研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)方法包括X射線晶體衍射技術(shù)和核磁共振技術(shù)，均屬于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，它們能夠準(zhǔn)確測(cè)定蛋白三維結(jié)構(gòu)，但同時(shí)也存在許多技術(shù)難點(diǎn)，尤其是膜蛋白晶體結(jié)構(gòu)難以獲得，使得OSCs蛋白方面的研究進(jìn)展十分緩慢［20］。為了加快新蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測(cè)定及其與化合物的相互作用方式，當(dāng)前通過(guò)PDB蛋白結(jié)構(gòu)信息庫(kù)中搜索已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)作為模板，利用同源建模軟件對(duì)新蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模是最為常用且有效的一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展及其在生物學(xué)研究中的突出作用，蛋白質(zhì)同源模建技術(shù)已經(jīng)成為一種可靠性高且被廣泛認(rèn)可的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)技術(shù)。任何一對(duì)氨基酸序列長(zhǎng)度大于80的蛋白質(zhì)，如果兩者的序列同源性超過(guò)30%，則可認(rèn)為它們具有相似的三維結(jié)構(gòu)，即蛋白質(zhì)的基本折疊相同［21］。本研究中所用的環(huán)阿屯醇合酶基因CAS的編碼區(qū)能夠編碼765個(gè)氨基酸，在 PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索發(fā)現(xiàn)蛋白1W6J和1W6K與CAS的氨基酸序列同源性高達(dá)49%。因此符合蛋白同源建模的條件，可以以此二者為模板對(duì)CAS的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。

關(guān)于OSCs晶體結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制的研究較少，Thoma等［22］首次報(bào)道了人氧化鯊烯環(huán)化酶LaS的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Asp455、Cys456、Cys533是催化環(huán)化形成的活性位點(diǎn)，而His232則是終止反應(yīng)的關(guān)鍵。Wu等［23］通過(guò)蛋白同源建模發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母ERG7的His234可與LaS His232疊合，后續(xù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該位點(diǎn)為催化氧化鯊烯環(huán)化形成多種不同結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的關(guān)鍵位點(diǎn)；Ma等［24］通過(guò)對(duì)黃瓜中的Bi蛋白進(jìn)行同源建模比對(duì)分析，推測(cè)Leu146和Tyr439為形成不同環(huán)化產(chǎn)物的活性位點(diǎn)；Hoshino等［17］也通過(guò)與LaS和SHC的同源建模闡述了催化β-AS形成的活性位點(diǎn)。以同源建模為基礎(chǔ)，分子對(duì)接則可以找到配體小分子與蛋白受體在其活性區(qū)域相結(jié)合時(shí)能量最低的構(gòu)象，Major等［25］利用此技術(shù)分析了三萜類化合物BPP形成的機(jī)制。所以，利用同源建模、分子對(duì)接等計(jì)算機(jī)軟件模擬技術(shù)已成為相關(guān)氧化鯊烯環(huán)化酶的活性位點(diǎn)及催化機(jī)制研究的有力工具。本研究用同源建模軟件對(duì)CAS蛋白結(jié)構(gòu)與其對(duì)應(yīng)底物2，3-氧化鯊烯和相應(yīng)碳正離子中間體的相互作用模式進(jìn)行模擬，結(jié)果表明CAS酶上的Asp491、Cys492、Cys570、Tyr540、His265殘基是催化環(huán)化的關(guān)鍵氨基酸。這些研究對(duì)進(jìn)一步運(yùn)用生物實(shí)驗(yàn)手段研究其結(jié)構(gòu)和功能，為設(shè)計(jì)高活性的酶以及調(diào)控次級(jí)代謝通路有重要意義。

隨著分子生物學(xué)研究的突飛猛進(jìn)，點(diǎn)突變技術(shù)成為一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用非常廣泛。通過(guò)同源建模和分子對(duì)接找到影響催化作用的活性位點(diǎn)氨基酸殘基，可很好地指導(dǎo)突變研究。定點(diǎn)突變技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)改造及結(jié)構(gòu)—功能關(guān)系研究中，如利用點(diǎn)飽和突變技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)，提高酶比活力，改善酶熱穩(wěn)定性、底物結(jié)合特異性及立體異構(gòu)特異性等多方面性質(zhì)［26］。通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，β-AS活性位點(diǎn)氨基酸的鑒別，催化機(jī)理、骨架形成的必須結(jié)構(gòu)單位等研究已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，且還獲得了幾十種具有藥用潛力的目標(biāo)化合物［17］。所以下一步，通過(guò)運(yùn)用點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)CAS關(guān)鍵活性位點(diǎn)進(jìn)行定向改造，可獲得具有巨大商業(yè)價(jià)值的目標(biāo)產(chǎn)物，同時(shí)通過(guò)改善酶活力、擴(kuò)大催化閾值可為中藥化學(xué)成分的高效合成提供新技術(shù)。

4 結(jié)論

本文通過(guò)同源建模和分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)CAS酶催化2，3-氧化鯊烯生成環(huán)阿屯醇的機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，Asp491、Cys492、Cys570、Tyr540、His265是CAS酶的關(guān)鍵催化位點(diǎn)，其中位于活性空腔頂部的Asp491、Cys492、Cys570通過(guò)質(zhì)子化2，3-氧化鯊烯上的環(huán)氧基來(lái)激活催化反應(yīng)，而位于活性口袋底部的Tyr540、His265則通過(guò)對(duì)底物去質(zhì)子化形成產(chǎn)物來(lái)終止反應(yīng)。此外，活性空腔內(nèi)存在大量的疏水氨基酸，則通過(guò)疏水作用穩(wěn)定反應(yīng)物、中間體結(jié)合在活性空腔。據(jù)此推測(cè)CAS酶催化機(jī)制為：Asp491質(zhì)子化2，3-氧化鯊烯引發(fā)四個(gè)環(huán)化反應(yīng)形成C20正離子中間體，然后中間體經(jīng)過(guò)一系列的碳正離子重排形成C11正離中間體，最后通過(guò)His265與Tyr540去質(zhì)子化使得C27與C11原子間形成單鍵生成產(chǎn)物環(huán)阿屯醇。