金孝偉 李哲煜 徐翩翩 張笑顏 任南琪 庫里連科·維塔利 孫凱

摘?要?發(fā)光細(xì)菌能夠發(fā)出波長為450～490 nm的可見光，其發(fā)光強(qiáng)度隨待測(cè)溶液中毒性物質(zhì)濃度增加而減弱。發(fā)光細(xì)菌法具有簡單、快速和高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)急性毒性分析。近年來，隨著微流控技術(shù)微型化、集成化和自動(dòng)化的不斷發(fā)展，基于微流控技術(shù)的發(fā)光細(xì)菌毒性分析裝置的研究越來越多。與傳統(tǒng)方法相比，微流控型生物傳感器所需菌液少，可以有效地避免人為誤差和外界條件干擾等，靈敏度更高。本文結(jié)合發(fā)光細(xì)菌的特點(diǎn)和發(fā)光機(jī)制，對(duì)微流控型生物發(fā)光傳感器及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

關(guān)鍵詞?發(fā)光細(xì)菌; 急性毒性; 環(huán)境污染物; 微流控; 生物傳感器; 評(píng)述

1?引 言

隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，當(dāng)今社會(huì)對(duì)環(huán)境污染物的監(jiān)測(cè)需求不斷增加。環(huán)境中的毒性物質(zhì)種類繁多，化學(xué)、物理以及生物檢測(cè)方法被逐步建立，其中建立較早的是化學(xué)方法，檢測(cè)體系相對(duì)完善，可實(shí)現(xiàn)大多數(shù)污染物的定性和定量檢測(cè)，但該方法只能獲得所測(cè)污染物的成分及濃度，無法直觀反映該污染物對(duì)生物體的毒性效應(yīng)。物理方法過程復(fù)雜，設(shè)備昂貴，多用于大氣和大面積水域污染的遙感監(jiān)測(cè)。生物分析方法利用生物體如微生物、植物、無脊椎動(dòng)物和魚類等對(duì)環(huán)境中的毒性物質(zhì)變化進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中， 基于微生物的生物分析方法因其簡便快速、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)毒性檢測(cè)。

發(fā)光細(xì)菌是一種在暗室中能發(fā)出肉眼可見的藍(lán)綠光的細(xì)菌，常用于水質(zhì)毒性檢測(cè)。發(fā)光細(xì)菌的生物毒性檢測(cè)依賴于其對(duì)環(huán)境中污染物的反應(yīng)，能夠體現(xiàn)污染物對(duì)生命個(gè)體的影響[1]及毒性效應(yīng)[2]，具有簡便快速、操作簡單、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，發(fā)光細(xì)菌的生物毒性檢測(cè)被用于各種環(huán)境污染物的毒性分析。Westlund等[3]研究了十余種農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌的急性和慢性毒性，發(fā)現(xiàn)部分農(nóng)藥15 min和30 min的EC50值相差幾十倍，說明僅考慮15 min的EC50值容易低估某些污染物的毒性。Liu等[4]以青?；【鸀槭茉嚿?， 研究了6種農(nóng)藥的單一及二元聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)二元聯(lián)合毒性是否高于單一物質(zhì)毒性主要取決于兩種物質(zhì)間的相互作用，如拮抗效應(yīng)使聯(lián)合毒性下降，協(xié)同效應(yīng)使聯(lián)合毒性增強(qiáng)等。Ding等[5]研究了6種鄰苯二甲酸酯及二價(jià)鎘對(duì)青?；【亩拘宰饔?，指出這6種鄰苯二甲酸酯與鎘的二元聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為相加效應(yīng)。發(fā)光細(xì)菌也常被用于評(píng)價(jià)新型材料的生物毒性。Rossetto等[6]利用費(fèi)氏弧菌測(cè)試了納米CuO顆粒與微米CuO顆粒的急慢性毒性，研究結(jié)果表明，納米顆粒的毒性高于微米顆粒的毒性，為納米毒理學(xué)研究提供了一種方法和便利工具。Costa等[7]通過一種全自動(dòng)流動(dòng)注射分析系統(tǒng)研究了7種離子液體對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性作用，指出離子液體的毒性作用與其結(jié)構(gòu)和組成有關(guān)，若陽離子含有苯環(huán)，其毒性大于不含苯環(huán)的結(jié)構(gòu)，而陰離子中含氟結(jié)構(gòu)的毒性大于不含氟結(jié)構(gòu)。

近年來，基于發(fā)光細(xì)菌的生物毒性檢測(cè)方法與微流控技術(shù)結(jié)合，使發(fā)光細(xì)菌的生物測(cè)試方法不斷向便攜化、集成化和智能化方向發(fā)展。微流控技術(shù)是在較小的芯片上完成進(jìn)樣、反應(yīng)、檢測(cè)于一體的分析裝置，具有快速、高效以及耗能低等優(yōu)點(diǎn)。研究人員將基于發(fā)光細(xì)菌的生物測(cè)試方法與微流控技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建出新的生物發(fā)光微分析系統(tǒng)，主要由三部分組成：（1）微流控芯片，含有微室陣列和微通道; （2）微室內(nèi)的活細(xì)胞，用于感知目標(biāo)物質(zhì)并反饋為生物發(fā)光信號(hào)的變化; （3）轉(zhuǎn)換器，將生物發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)?；诎l(fā)光細(xì)菌的發(fā)光原理以及微流控的技術(shù)思想，本文對(duì)基于發(fā)光細(xì)菌的微流控型生物傳感器的原理及應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

2?發(fā)光細(xì)菌及其發(fā)光機(jī)制

發(fā)光細(xì)菌分布廣泛，主要存在于海洋中，是一種能夠發(fā)出微弱藍(lán)綠可見光的細(xì)菌，其最大發(fā)射波長在450～490 nm之間[8]，屬革蘭氏陰性、兼性好氧型細(xì)菌[9]。目前，已知發(fā)光細(xì)菌分為4個(gè)屬：弧菌屬（Vibrio）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）和光桿菌屬（Photorhabdus）[10]，其中典型菌，如明亮發(fā)光桿菌、費(fèi)氏弧菌和青?；【缺粡V泛應(yīng)用于毒性分析。

發(fā)光細(xì)菌中存在由NAD（P）H：FMN氧化還原酶和熒光素酶組成的酶系統(tǒng)，當(dāng)黃素酸（FMN）、輔酶Ⅱ[NAD（P）H]、八碳以上的長鏈脂肪醛（RCHO）和分子氧（O2）存在時(shí)，酶系統(tǒng)發(fā)出約490 nm的光，反應(yīng)方程式如下：

細(xì)菌熒光素酶是一種單加氧酶，能將分子氧（O2）中的一個(gè)氧原子轉(zhuǎn)移到還原型黃素單核苷酸（FMNH2）上，使其氧化成黃素單核苷酸（FMN），另一個(gè)氧原子加到長鏈脂肪醛（RCHO）結(jié)合生成相應(yīng)的長鏈脂肪酸。熒光素酶自身無法催化黃素的還原，因此需要借助輔酶Ⅱ[NAD（P）H]催化，完成生物發(fā)光過程。由于FMNH2/ FMN也作為細(xì)菌呼吸代謝的重要參與物質(zhì)，所以細(xì)菌的發(fā)光反應(yīng)可看作是呼吸作用中電子轉(zhuǎn)移到氧分子的一個(gè)代謝旁路，可以調(diào)節(jié)還原型黃素單核苷酸的水平。在能量代謝或分解代謝的脫H反應(yīng)中，輔酶Ⅰ（NAD）接受H之后必須將H轉(zhuǎn)給FMN，將其還原為FMNH2后方能進(jìn)入呼吸產(chǎn)能階段。此時(shí)，細(xì)菌熒光素酶類似一個(gè)黃素單加氧酶，或是一種平衡功能的氧化酶，能減少還原型黃素單核苷酸的生成，增加電子代謝通路的還原功能，因此對(duì)細(xì)胞代謝是有利的[11]。分子氧與還原型黃素單核苷酸生成熒光素酶-黃素過氧化物，該過氧化物降解產(chǎn)生的能量生成單線態(tài)的激發(fā)分子，并在退激時(shí)發(fā)射光子。通常， 過氧鍵斷裂后被兩個(gè)更強(qiáng)的化學(xué)鍵取代，并伴隨著能量的產(chǎn)生，部分能量用于生物發(fā)光。

3?基于發(fā)光細(xì)菌的微流控系統(tǒng)

發(fā)光細(xì)菌接觸污染物后，酶系統(tǒng)受到破壞或者細(xì)胞死亡都會(huì)導(dǎo)致其發(fā)光強(qiáng)度下降。部分污染物能夠與發(fā)光細(xì)菌的熒光素酶結(jié)合，從而干擾細(xì)菌的生物發(fā)光過程; 有的污染物則是通過破壞細(xì)胞表面的感受器，擾亂細(xì)胞膜功能，甚至與細(xì)胞組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞失活從而降低發(fā)光強(qiáng)度。因此，根據(jù)污染物對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度抑制作用的不同，發(fā)光細(xì)菌可以用于評(píng)估污染物的毒性效應(yīng)[12]。

自Karube提出生物傳感器的概念[13]，生物傳感器在環(huán)境污染物檢測(cè)方面得到快速發(fā)展，尤其是微流控型生物傳感器備受關(guān)注?；诎l(fā)光細(xì)菌的微流控型生物傳感器中，細(xì)菌所處狀態(tài)有多種形式[14]，包括處于液體中的懸浮態(tài)、被制作成凍干粉的凍干態(tài)和固定在一次性樣品池、光纖或生物芯片上的固定態(tài)，其中常用的是懸浮態(tài)和固定態(tài)。

3.1?細(xì)菌固定型微流控生物傳感器

細(xì)菌固定型微流控生物傳感器根據(jù)細(xì)菌固定方式的不同可分為藻酸鈣固定、瓊脂固定以及海藻酸鈉薄片固定等，以下分別對(duì)上述幾種固定方式的生物傳感器進(jìn)行介紹。

Eltzov等[18]研發(fā)了一種檢測(cè)水中有毒污染物的在線光纖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。將分別攜帶recA（DNA損傷）和grpE（熱休克）啟動(dòng)因子的兩株細(xì)菌懸浮液與2%海藻酸鈉溶液按體積比1：1混合均勻后，涂布在光纖頭部，隨后涂布0.5 mol/L CaCl2溶液，使其反應(yīng)形成藻酸鈣，將細(xì)菌固定在光纖頭部。作者首先對(duì)系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)行24 h所需的條件進(jìn)行優(yōu)化，并在流動(dòng)狀態(tài)下檢測(cè)自來水和地表水中的污染物。初步實(shí)驗(yàn)表明，添加7.5%的LB培養(yǎng)基是保證設(shè)備在流動(dòng)水體中長時(shí)間（>1 h）運(yùn)行的必要條件。在對(duì)自來水的水質(zhì)監(jiān)測(cè)中，該系統(tǒng)能夠穩(wěn)定運(yùn)行24 h，但在地表河流的水質(zhì)監(jiān)測(cè)中，由于流體不斷沖擊光纖頭部，使其固定的發(fā)光細(xì)菌逐漸減少，系統(tǒng)在運(yùn)行20 h后很難對(duì)污染物繼續(xù)產(chǎn)生響應(yīng)。隨后，作者對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行深入優(yōu)化[20]，首先調(diào)整培養(yǎng)基成分和濃度，然后通過在流體出口增加蠕動(dòng)泵的方式研究不同流速對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，并為光纖探針增設(shè)水流緩沖保護(hù)罩以降低流體剪切力。優(yōu)化后的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)不僅能快速檢測(cè)到水質(zhì)變化，而且將最大流速從3 L/h提高到10 L/h，在相同的時(shí)間內(nèi)完成了更大體積量的水樣檢測(cè)。同時(shí)，該設(shè)備實(shí)現(xiàn)了對(duì)流動(dòng)水體中的污染物毒性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可為水源地取水口或飲用水管網(wǎng)等重要節(jié)點(diǎn)的水質(zhì)安全提供早期預(yù)警功能。

Jouanneau等[17]設(shè)計(jì)了兩種基于發(fā)光細(xì)菌不同保存方式的生物傳感器（“Lumisens Ⅲ”和“Lumisens Ⅳ”），用于在線檢測(cè)環(huán)境樣品中的重金屬。其中，Lumisens Ⅲ系統(tǒng)中的細(xì)菌懸浮液與4%的瓊脂糖溶液混勻后，固定在有連續(xù)流驅(qū)動(dòng)的微井中，生物活性較高; 而Lumisens Ⅳ系統(tǒng)中使用的細(xì)菌在96孔微板中進(jìn)行冷凍干燥，活性相對(duì)較低。兩套系統(tǒng)均封閉于暗箱中，利用CCD相機(jī)對(duì)細(xì)菌發(fā)出的光信號(hào)進(jìn)行圖像捕捉并記錄。在10 d 內(nèi)，作者分別利用兩種生物傳感器連續(xù)檢測(cè)蒸餾水或環(huán)境樣品中的汞（Hg），每天將系統(tǒng)中的發(fā)光細(xì)菌暴露于含有500 nmol/L Hg的樣品中100 min，其余時(shí)間持續(xù)通入細(xì)菌培養(yǎng)液。結(jié)果表明，Lumisens Ⅲ系統(tǒng)自啟動(dòng)6 h后產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)，在測(cè)試的10 d內(nèi)生物發(fā)光水平不穩(wěn)定，變化率達(dá)40%，固定化細(xì)菌在第3～6 d處于穩(wěn)定生長階段，生物發(fā)光信號(hào)的重現(xiàn)性和重復(fù)性接近5%。Lumisens Ⅳ系統(tǒng)啟動(dòng)1.5 h后便可獲得響應(yīng)信號(hào)，生物發(fā)光信號(hào)的重現(xiàn)性達(dá)3%，在10 d內(nèi)可達(dá)到Hg的穩(wěn)定檢測(cè); 在Lumisens Ⅲ系統(tǒng)中，細(xì)菌易受到暴露的污染物的影響，導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)菌活性降低，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性; 在Lumisens Ⅳ系統(tǒng)中，細(xì)菌被限定在微孔板中的各個(gè)微孔中，執(zhí)行獨(dú)立地單次分析，但操作相對(duì)繁瑣，重復(fù)性較低。

Elad等[21]開發(fā)了一種在線連續(xù)監(jiān)測(cè)水質(zhì)毒性的流通式生物傳感器。瓊脂固定化重組發(fā)光細(xì)菌的模塊化生物芯片是該裝置的核心部分，單光子雪崩二極管探測(cè)器（SPAD）為響應(yīng)信號(hào)探測(cè)裝置。作者配備了誘導(dǎo)型和組成型兩種菌株，并在連續(xù)的水流中持續(xù)放置10 d，這段時(shí)間里分別連續(xù)通入萘啶酸、百草枯、As和上述3種物質(zhì)的混合液以及一個(gè)工業(yè)廢水水樣2 h。通過比較固定態(tài)和懸浮態(tài)下細(xì)菌對(duì)同種濃度污染物的響應(yīng)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)懸浮態(tài)的細(xì)菌對(duì)污染物的靈敏度更高，但穩(wěn)定性略低于固定態(tài)，且重復(fù)性接近20%。該傳感器對(duì)6和0.01 mg/L的As以及0.02和0.005 mg/L的Sb具有很好的識(shí)別作用，且檢測(cè)濃度滿足美國和歐盟飲用水水質(zhì)安全標(biāo)準(zhǔn)的檢出限要求。該生物傳感器能夠在0.5～2.5 h內(nèi)檢測(cè)到所有的模擬污染事件，并根據(jù)污染性質(zhì)反饋特定的響應(yīng)信號(hào)，可用于防止有毒化學(xué)品意外泄露或水源地有毒物質(zhì)故意投放等預(yù)警系統(tǒng)，并與相關(guān)物化方法互補(bǔ)，構(gòu)成水質(zhì)安全保障網(wǎng)絡(luò)。

近年來，基于發(fā)光細(xì)菌的生物傳感器對(duì)于水質(zhì)毒性檢測(cè)的研究較多，用于氣體毒性檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道較少。Eltzov等[22]設(shè)計(jì)的空氣毒性檢測(cè)傳感器在室內(nèi)空氣毒性監(jiān)測(cè)方面表現(xiàn)優(yōu)異，該系統(tǒng)的核心部分主要包括：（1）光電倍增管，用于檢測(cè)細(xì)菌的響應(yīng); （2）液體光導(dǎo)管，用于光信號(hào)傳輸; （3）海藻酸鈉薄片，用于固定細(xì)菌。作者將grpE啟動(dòng)因子改造后的大腸桿菌培養(yǎng)液與過濾滅菌的2%（w/V）低粘度海藻酸鈉溶液以體積比1∶1混合，在直徑為0.6 mm的圓柱體中滴入0.5 mmol/L CaCl2溶液30 μL及海藻酸鈉與發(fā)光細(xì)菌的混合液50 μL，制成固定薄片。作者首先對(duì)細(xì)菌固定薄片進(jìn)行優(yōu)化，將細(xì)菌固定薄片放入20 mL管中并在其附近滴加1 μL氯仿，通過研究細(xì)菌固定薄片的不同朝向位置、環(huán)境溫度以及暴露時(shí)間對(duì)傳感器靈敏度的影響，發(fā)現(xiàn)正面朝向可以提高化學(xué)物質(zhì)擴(kuò)散到基質(zhì)中的擴(kuò)散速率，表明升高環(huán)境溫度或延長暴露時(shí)間可以提高細(xì)胞的響應(yīng)強(qiáng)度。隨后，研究人員在一間辦公室里放入集成好的裝置，將幾種空氣中常見的污染物，如香煙的煙霧、丙酮和油漆（含有三氯甲烷）等釋放進(jìn)房間，記錄生物傳感器對(duì)各種污染物的響應(yīng)程度。研究表明，生物傳感器對(duì)幾種污染物的響應(yīng)結(jié)果顯示了其對(duì)室內(nèi)環(huán)境中有毒物質(zhì)的響應(yīng)能力，其中對(duì)丙酮的響應(yīng)最為強(qiáng)烈，對(duì)油漆中的三氯甲烷次之。

雖然生物傳感器和傳統(tǒng)的分析方法都能夠定性分析空氣樣品中的污染物類型，但傳統(tǒng)方法仍然存在價(jià)格昂貴、需要特殊的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備以及不適于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等問題，且所需操作人員技術(shù)要求嚴(yán)格是阻礙傳統(tǒng)方法在毒性監(jiān)測(cè)中廣泛應(yīng)用的最大問題。與之相反，生物傳感器操作簡單、靈敏便捷，對(duì)構(gòu)建新型空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)裝置具有重要的指導(dǎo)意義。

細(xì)菌固定化雖然可以限制細(xì)菌向周圍環(huán)境中擴(kuò)散，且可以在污染物移除后繼續(xù)重復(fù)利用某些生物元素，提高生物傳感器的使用壽命。但這種方法在原位應(yīng)用中存在一些問題，如固定的細(xì)菌會(huì)隨著時(shí)間的推移發(fā)生變化，影響對(duì)污染物的響應(yīng); 由于細(xì)菌的擴(kuò)散和游動(dòng)受到限制，使其與污染物的接觸不夠充分，從而導(dǎo)致實(shí)際應(yīng)用過程中的檢測(cè)信號(hào)較低; 用于固定細(xì)菌的一次性芯片需要頻繁更換，因而在快速檢測(cè)大量污染物時(shí)消耗量較大。因此，對(duì)于短時(shí)間內(nèi)的連續(xù)快速檢測(cè)而言，懸浮型的生物傳感器更具優(yōu)勢(shì)。

3.2?細(xì)菌懸浮型微流控生物傳感器

1996年，Gu等[23]最先制作出一種用于測(cè)試細(xì)胞對(duì)有毒物質(zhì)響應(yīng)的連續(xù)流微型生物反應(yīng)器，該微型反應(yīng)器類似一個(gè)沒有探針控制的簡化生物培養(yǎng)反應(yīng)器。在連續(xù)流的培養(yǎng)狀態(tài)下，重組生物發(fā)光大腸桿菌可以保持最佳的生理狀態(tài)。這種微型生物反應(yīng)器的容積約58 mL，可以長期連續(xù)操作，具有較高的穩(wěn)定性和可靠性。作者研究了在連續(xù)流狀態(tài)下重組生物發(fā)光大腸桿菌對(duì)乙醇的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)菌發(fā)光水平取決于菌液的最終稀釋倍數(shù)。高稀釋倍率下的發(fā)光細(xì)菌處于非?；钴S的代謝狀態(tài)，對(duì)環(huán)境的刺激響應(yīng)較為迅速，菌液的稀釋倍數(shù)越高，反應(yīng)器的靈敏度越高，響應(yīng)越快。1999年，多通道形式的微型反應(yīng)器得以進(jìn)一步開發(fā)制作，其主要包括兩個(gè)反應(yīng)器：一個(gè)用于維持細(xì)菌處于穩(wěn)定狀態(tài)，并向另一個(gè)反應(yīng)器持續(xù)供應(yīng)新鮮細(xì)菌; 另一個(gè)用于發(fā)光細(xì)菌與待測(cè)物質(zhì)的接觸混合，完成檢測(cè)分析[24]。但是由于該系統(tǒng)細(xì)菌未被固定，因此無法保證檢測(cè)的穩(wěn)定性。

2003年，Thouand等[25]開發(fā)了一種基于三甲基錫誘導(dǎo)發(fā)光的基因工程發(fā)光細(xì)菌生物傳感器。細(xì)菌在一個(gè)容積約100 mL的專用生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，反應(yīng)器頂部設(shè)有培養(yǎng)基和待測(cè)物質(zhì)的出入口，并插入傳感器實(shí)時(shí)測(cè)量反應(yīng)器內(nèi)的pH值、溫度、溶解氧和細(xì)胞密度，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌的生長狀態(tài)。為了篩選用于傳感器的最佳培養(yǎng)基，作者分別利用肉湯培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，在培養(yǎng)進(jìn)入指數(shù)期后，均加入0.001～10.0 μmol/L三甲基錫進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果表明，采用葡萄糖培養(yǎng)基，且三甲基錫達(dá)到1.5 μmol/L時(shí)，細(xì)菌的發(fā)光最強(qiáng)，隨著樣品濃度增加，毒性增大，發(fā)光強(qiáng)度降低; 在采用肉湯培養(yǎng)基過程中，三甲基錫濃度為10 μmol/L時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度最大，并且其發(fā)光強(qiáng)度只有前者的1/4。該系統(tǒng)主要特點(diǎn)在于： （1）光纖被固定于反應(yīng)器蓋子上，不與細(xì)菌和樣品接觸，避免了生物膜形成可能導(dǎo)致的光輸出損失; （2）引入多個(gè)微探針以評(píng)估細(xì)菌連續(xù)生長過程中的活性; （3）設(shè)備具有自動(dòng)化、集成化、便攜等優(yōu)點(diǎn)。但該生物傳感器檢測(cè)時(shí)間較長，通量低。

Zhao等[26]研發(fā)了一種基于發(fā)光細(xì)菌的飲用水中毒物檢測(cè)的微流控裝置，該裝置以費(fèi)氏弧菌為受試生物，監(jiān)測(cè)水中潛在的重金屬離子和苯酚等細(xì)胞毒性物質(zhì)，且配有獨(dú)立的細(xì)菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。其芯片包括兩個(gè)逆流混合器和一個(gè)T型液滴生成器，以及6個(gè)螺旋微通道，此設(shè)計(jì)可實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的連續(xù)檢測(cè)。將細(xì)胞懸浮液和水樣引入微混合器中充分混合，隨后分散到氣流中生成氣包水液滴，保證傳感器內(nèi)的發(fā)光細(xì)菌可以獲得充足的養(yǎng)分供應(yīng)。作者選擇Cu2+、Zn2+、重鉻酸鉀以及3，5-二氯苯酚作為典型毒物進(jìn)行測(cè)試，以驗(yàn)證系統(tǒng)靈敏度。在測(cè)試過程中，Zn2+的濃度與相對(duì)發(fā)光單位之間存在非線性關(guān)系。初步測(cè)試表明，該系統(tǒng)只能對(duì)水中簡單有毒化學(xué)物質(zhì)的濃度進(jìn)行粗略估計(jì)，不能識(shí)別或量化特定污染物，但可在大量待測(cè)樣品中快速篩選有毒物質(zhì)，其作為一種有效的急性毒性毒物篩選工具，具有良好的應(yīng)用前景。

4?基因操控以提高發(fā)光細(xì)菌生物傳感器性能

重組的發(fā)光細(xì)菌是通過向宿主細(xì)胞插入或轉(zhuǎn)染攜帶啟動(dòng)子和目的基因（lux基因）的質(zhì)粒構(gòu)建而成。啟動(dòng)子負(fù)責(zé)特異性識(shí)別，目的基因指導(dǎo)氧化熒光素酶的合成，使重組細(xì)菌具有發(fā)光性能[27]。啟動(dòng)子是位于編碼基因前端的非編碼DNA序列，在RNA聚合酶識(shí)別后其下游基因的轉(zhuǎn)錄得以啟動(dòng)。因此，為提高發(fā)光細(xì)菌生物傳感器的整體分析性能，研究人員通常對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分子改造。

根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，研究人員已經(jīng)構(gòu)建了大量含有不同啟動(dòng)子的工程菌株。不同來源的生物發(fā)光基因在導(dǎo)入細(xì)菌過程中都必須考慮其具體特性，例如，在費(fèi)氏弧菌的發(fā)光基因植入大腸桿菌的過程中，費(fèi)氏弧菌中熒光素酶保持活性所需溫度低于大腸桿菌（37℃）。而研究發(fā)現(xiàn)，明亮發(fā)光桿菌則與大腸桿菌保持活性所需溫度一致，因此研究人員將其發(fā)光基因轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中，進(jìn)而獲得了更短的響應(yīng)時(shí)間[28，29]。Yagur-Kroll等[30]提出了4種通過操控啟動(dòng)子來增強(qiáng)發(fā)光細(xì)菌生物傳感器性能的方法： （1）修改包含啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段的長度; （2）通過定向進(jìn)化過程引入一個(gè)隨機(jī)基因突變體; （3）在啟動(dòng)子序列中引入更多特定的位點(diǎn)突變體; （4）復(fù)制啟動(dòng)子序列，以增加RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)。通過這四種方法，可顯著提高生物傳感器的靈敏度、響應(yīng)時(shí)間以及發(fā)射光強(qiáng)度。

發(fā)光細(xì)菌含有使其發(fā)光的lux操縱子luxCDABEG，其中，luxA和luxB基因分別負(fù)責(zé)細(xì)菌熒光素酶中的α亞基和β亞基的編碼，而luxC、luxD、luxE基因則負(fù)責(zé)脂肪酸還原酶中r、s、t多肽的編碼，luxG負(fù)責(zé)黃素還原酶的基因編碼[31]。從不同種類發(fā)光細(xì)菌中分離出的lux基因種類與數(shù)量并不完全相同，但以上提到的6個(gè)基因中， luxC、luxD、luxA、luxB和luxE存在于已發(fā)現(xiàn)的所有發(fā)光細(xì)菌中，其中l(wèi)uxG基因在發(fā)光桿菌屬的lux操縱子中沒有發(fā)現(xiàn)。到目前為止，發(fā)光細(xì)菌的lux基因常被用于制造重組細(xì)菌來進(jìn)行生物測(cè)試，從而提高生物發(fā)光強(qiáng)度，降低檢測(cè)限，并且縮短響應(yīng)時(shí)間。

細(xì)菌中l(wèi)ux基因受上游啟動(dòng)子序列的調(diào)控，因此，提高生物發(fā)光性能除了可以對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分子調(diào)控外，還可以通過拆分lux基因來實(shí)現(xiàn)[32]。luxCDABE可分成兩個(gè)較小的基因片段，即luxAB和luxCDE，前者負(fù)責(zé)熒光素酶的編碼，后者負(fù)責(zé)指導(dǎo)合成生物發(fā)光反應(yīng)所需要的長鏈脂肪醛。對(duì)這兩個(gè)基因片段進(jìn)行修飾，使其處于誘導(dǎo)型應(yīng)激反應(yīng)啟動(dòng)子或合成的組成型啟動(dòng)子的控制下。研究人員通過對(duì)誘導(dǎo)型或組成型的luxAB與誘導(dǎo)型或組成型的luxCDE進(jìn)行多種組合后，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型luxAB和組成型luxCDE是最佳組合方式，這種組合方式能夠增強(qiáng)細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度，加快反應(yīng)速度。

隨著基因工程技術(shù)逐漸成熟，將攜帶lux基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到非發(fā)光細(xì)菌中的方法已被廣泛使用。研究人員可根據(jù)特定污染物選擇適合的細(xì)菌進(jìn)行基因改造，獲得特異性重組的發(fā)光細(xì)菌，進(jìn)而獲得更高靈敏度，更寬響應(yīng)范圍的發(fā)光細(xì)菌生物傳感器。但是基因工程菌的生長環(huán)境、生長條件和規(guī)律是否變化，對(duì)污染物毒性檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性是否有提高，以及需要何種條件的污染物誘導(dǎo)亟待進(jìn)一步研究。因此，借助微流控技術(shù)的微腔室、微混合器與多種多樣的原位檢測(cè)技術(shù)帶來的微環(huán)境梯度形成與高通量等特點(diǎn)，將大大加快優(yōu)化條件的篩選過程。

5?結(jié) 語

發(fā)光細(xì)菌法因其靈敏度高、反應(yīng)速度快、操作簡便以及容易實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)等特點(diǎn)在水質(zhì)急性毒性檢測(cè)方面發(fā)揮著巨大作用，其與光纖技術(shù)、傳感技術(shù)以及微流控技術(shù)的結(jié)合可以靈活應(yīng)對(duì)各種復(fù)雜的檢測(cè)環(huán)境。發(fā)光細(xì)菌毒性分析方法適用于快速篩選大量樣品，將其與其它分析方法相結(jié)合， 可對(duì)樣品進(jìn)行深度檢測(cè)以提供全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果?；诎l(fā)光細(xì)菌的各類生物傳感器將在防止有毒化學(xué)物質(zhì)故意或意外滲入到地表水或市政水網(wǎng)等系統(tǒng)的應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用，為環(huán)境安全提供保障。

分子生物學(xué)的發(fā)展有望使發(fā)光細(xì)菌針對(duì)特定污染物產(chǎn)生特異性響應(yīng)，擴(kuò)充發(fā)光細(xì)菌的應(yīng)用范圍。將發(fā)光細(xì)菌與先進(jìn)的材料、設(shè)備或技術(shù)（如微/納流體、先進(jìn)的光學(xué)材料等）相結(jié)合以提高整個(gè)測(cè)試系統(tǒng)的效率， 也將成為其發(fā)展的一個(gè)重要方向。此外，微通道內(nèi)的高壓強(qiáng)與低溶解氧環(huán)境對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響仍然存在，微流控技術(shù)中微納氣泡的生成和操控將是解決這一問題的關(guān)鍵。

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