李萍 汪青青 趙鵬英 周坤

摘? ? 要：為優(yōu)化八角茴香油的提取工藝并開發(fā)其作為植物源抗菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和食品保鮮領(lǐng)域，試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)篩選最佳萃取溶劑，并確定提取前物料粉末浸泡時(shí)間，利用單因素試驗(yàn)結(jié)合L9（34）正交試驗(yàn)篩選料液比、蒸餾時(shí)間和物料粉碎度的最優(yōu)組合，并通過濾紙片法測(cè)定八角茴香油抑菌活性。結(jié)果表明，八角茴香油最佳提取工藝條件為料液比1∶20 g·mL-1，水蒸氣蒸餾時(shí)間50 min，八角果實(shí)粉碎度0.30～0.45 mm（篩孔徑），以石油醚（30～60 ℃）作為萃取溶劑，提取前將八角茴香粉末浸泡36 h，在此條件下八角茴香油提取率可達(dá)14.657%。八角茴香油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌，其抑菌活性隨著八角茴香油濃度的增加而增大;八角茴香揮發(fā)性成分的油相部分（八角茴香油）抑菌效果優(yōu)于水溶性組分，但濃度為1 000.0 mg·mL-1的水溶性組分對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌仍然具有中度敏感的抑制效果，因此，應(yīng)綜合利用八角茴香揮發(fā)性成分（八角茴香油和水溶性組分）。

關(guān)鍵詞：八角茴香油;水蒸氣蒸餾法;提取工藝優(yōu)化;抑菌活性

中圖分類號(hào)：Q946.85， O658.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.02.002

Abstract： In order to optimize the extraction process of star anise oil and develop it as a plant-derived antibacterial agent for agricultural and food preservation， hydro-distillation method was carried out to extract star anise oil. According to the single factor test， using the extraction rate as an evaluation index， the best extraction solvent was screened， and the soaking time of the material powder before extraction was determined. The optimum combination of material-liquid ratio， hydro-distillation time and powder granularity of the material were screened by single factor test combined with L9（34） orthogonal test， the antibacterial activity was determined by the method of agar disc diffusion. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： ratio of material to distilled water was 1∶20 g·mL-1， hydro-distillation time was 50 min， powder granularity of the material was 0.30～0.45 mm， the star anise powder was presoaked 36 h， petroleum ether （30～60 °C） as the extraction solvent and under these conditions the extraction rate could reach 14.657%. The inhibitory effect of star anise oil on Bacillus subtilis was better than that of Escherichia coli， and the antibacterial effect increased with the concentration of star anise oil. Though the antibacterial effect of oil phase of the volatile constituents of the star anise（e.g. star anise oil） was better than the water-soluble components， the water-soluble components with a concentration of 1 000.0 mg·mL-1 still showed moderate inhibition effect against E. coli and B. subtilis. Therefore， the volatile constituents of star anise （star anise oil and water-soluble components） should be used in combination.

Key words：? star anise oil; hydro-distillation; optimization of extraction process; antibacterial activity

植物精油具有抗菌活性，被作為防腐劑應(yīng)用廣泛，其中，八角茴香油是從八角茴香的果實(shí)、枝、葉等部位提取得到的組成復(fù)雜的混合物，具有殺菌、殺蟲、抗氧化等生物活性[1-3]，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。提取方法不同，所得八角茴香油外觀品質(zhì)、化學(xué)組成和生物活性存在較大差異[4]。索氏[5]和超聲波法[6]提取，需要大量的有機(jī)溶劑且能耗較大，所得八角茴香油呈樹脂狀態(tài)，顏色較深，外觀品質(zhì)較差;超臨界流體法萃取的八角茴香油外觀品質(zhì)較好，但設(shè)備昂貴，操作成本高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[7];水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油為無色至淺黃色澄清液體，外觀品質(zhì)好，常用于醫(yī)藥、食品保鮮和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[8]。

本研究采用水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，采用濾紙片法研究八角茴香油的抑菌活性，為開發(fā)利用八角茴香油作為植物源抗菌劑用于農(nóng)業(yè)和食品保鮮領(lǐng)域提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與菌種

大紅八角：產(chǎn)地廣西，購于超市，室溫下陰干2周，粉碎，過篩，備用。

供試菌種：大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，由天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，4 ℃斜面保存，用前活化2次。細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

正己烷、環(huán)己烷、石油醚（30～60 ℃）、乙酸乙酯、無水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、氯化鈉、無水硫酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

DX-35BI型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;Thermo Scientific MSC-AdvantageⅡ級(jí)生物安全柜：德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;LRH-250-S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分提取? ? 稱取10 g（準(zhǔn)確至0.000 1 g）八角茴香粉末置于500 mL 圓底燒瓶中，按一定的料液比加入蒸餾水，安裝好水蒸氣蒸餾裝置，加熱蒸餾一定時(shí)間，收集餾出液（油水混合物），鹽析，轉(zhuǎn)入分液漏斗，有機(jī)溶劑萃取2次（每次15 mL），合并有機(jī)溶劑層，無水硫酸鈉干燥1 h，過濾，蒸除溶劑，得八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分（即八角茴香油），稱重，計(jì)算提取率。

1.3.2 八角茴香油提取的試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素試驗(yàn)考察萃取溶劑、物料粉末浸泡時(shí)間、料液比、蒸餾時(shí)間和物料粉碎度對(duì)八角茴香油提取效果的影響。在此基礎(chǔ)上，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)料液比、蒸餾時(shí)間和物料粉碎度用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。

1.3.3 八角茴香揮發(fā)性成分的水溶性組分提取[9]? ? 從水蒸氣蒸餾提取八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分的餾出液恰好變澄清開始，更換接收瓶，繼續(xù)收集餾出液，至圓底燒瓶?jī)?nèi)的液體幾乎蒸干，所得餾出液鹽析，轉(zhuǎn)入分液漏斗，有機(jī)溶劑萃取2次（每次15 mL），合并有機(jī)溶劑層，無水硫酸鈉干燥1 h，過濾，蒸除溶劑，得八角茴香揮發(fā)性成分的水溶性組分。

1.3.4 抑菌活性測(cè)定 供試樣品溶液的配制：八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分（八角茴香油）和水溶性組分，初始濃度均為1 000.0 mg·mL-1，用DMF作溶劑，采用2倍連續(xù)稀釋法配成一系列不同濃度的供試樣品溶液。

菌懸液的制備：將斜面活化好的細(xì)菌接入液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落數(shù)[10]。無菌水稀釋，制成含菌數(shù)為107 cfu·mL-1的菌懸液。

抑菌活性測(cè)定：采用濾紙片法測(cè)定[11-12]。取6 mm的濾紙片，紫外滅菌0.5 h后，浸入不同濃度的八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分和水溶性組分供試樣品溶液中，備用。滅菌培養(yǎng)基冷至50 ℃，倒入培養(yǎng)皿中（直徑9 cm），每皿20 mL，固化45 min。將200 μL菌懸液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，制成含菌平板。取浸泡不同濃度待測(cè)樣品溶液的濾紙片貼在含菌平板上，每皿均勻貼3片，DMF作空白對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)3次，倒置培養(yǎng)法37 ℃培養(yǎng)24 h。以十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單位mm。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用origin 8.5制圖，SPSS statistics 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水蒸氣蒸餾后萃取八角茴香油溶劑的選擇

由表1可知，溶劑對(duì)八角茴香油萃取得率順序?yàn)椋簾o水乙醇>乙酸乙酯>石油醚>環(huán)己烷>正己烷。無水乙醇和乙酸乙酯分別為極性和中等極性溶劑，萃取八角茴香油得率較高，但產(chǎn)品均為紅褐色液體，外觀品質(zhì)較差，靜置后有沉淀物，說明所得八角茴香油中雜質(zhì)較多，且兩種溶劑沸點(diǎn)相對(duì)較高，蒸除時(shí)能耗較大。石油醚、正己烷和環(huán)己烷均屬于非極性溶劑，其中石油醚萃取八角茴香油提取率高于正己烷和環(huán)己烷，所得八角茴香油為淺黃色澄清液體，具有濃郁的八角茴香氣味，外觀品質(zhì)較好，適宜用于食品保鮮或醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，且石油醚沸點(diǎn)低，蒸除時(shí)能耗較小。因此，選擇石油醚（30～60 ℃）作為水蒸氣蒸餾后萃取八角茴香油的最佳溶劑。

2.2 物料粉末浸泡時(shí)間對(duì)八角茴香油提取效果的影響

八角茴香粉末10 g（0.20～0.30 mm，篩孔徑），按料液比1∶15 g·mL-1加入蒸餾水，分別浸泡0，6，12，24，36，48，60 h后，水蒸氣蒸餾40 min，按1.3.1中的方法提取八角茴香油（萃取溶劑為石油醚，30～60 ℃，下同），考察物料粉末浸泡時(shí)間對(duì)八角茴香油提取效果的影響。

隨著物料粉末浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，八角茴香油提取率增加，但當(dāng)浸泡時(shí)間超過36 h之后提取率基本保持不變，且浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，水溶液容易出現(xiàn)長(zhǎng)菌現(xiàn)象。因此，選擇在水蒸氣蒸餾提取八角茴香油之前，先將物料粉末浸泡36 h以增加八角茴香油提取效果。

2.3? ? 八角茴香油提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1? ?料液比 八角茴香粉末10 g（0.20～0.30 mm，篩孔徑）分別按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g·mL-1料液比加入蒸餾水，浸泡36 h后，水蒸氣蒸餾40 min，按1.3.1中的方法提取八角茴香油，考察料液比對(duì)八角茴香油提取效果的影響。

隨著水蒸氣蒸餾時(shí)水的用量的加大，八角茴香油提取率先增加后降低，料液比為1∶20 g·mL-1時(shí)，提取率達(dá)到最高，為13.69%，此后再增加水量，提取率反而迅速下降。因此，選擇1∶20 g·mL-1為水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油的最佳料液比，1∶15、1∶20、1∶25 g·mL-1作為正交試驗(yàn)水平。

2.3.2 蒸餾時(shí)間 八角茴香粉末10 g（0.20～0.30 mm，篩孔徑）按1∶ 20 g·mL-1加入蒸餾水，浸泡36 h后，水蒸氣蒸餾，時(shí)間分別為10，20，30，40，50，60 min，按1.3.1中的方法提取八角茴香油，考察蒸餾時(shí)間對(duì)八角茴香油提取效果的影響。

隨著水蒸氣蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)，八角茴香油提取率先增大后減小，至40 min時(shí)達(dá)到最大值，此后，蒸餾時(shí)間再延長(zhǎng)，提取率反而下降，這可能是由于蒸餾時(shí)間過長(zhǎng)，在較高溫度下，八角茴香油揮發(fā)損失導(dǎo)致。此外，蒸餾時(shí)間過長(zhǎng)，燒瓶中水量蒸發(fā)加快，還存在蒸干的危險(xiǎn)。因此，選擇40 min為水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油的最佳蒸餾時(shí)間，30，40，50 min作為正交試驗(yàn)水平。

2.3.3 物料粉碎度 八角茴香粉末10 g（篩孔徑<0.15，0.15～0.20，0.20～0.30，0.30～0.45，0.45～0.90，>0.90 mm）按料液比1∶20 g·mL-1加入蒸餾水，浸泡36 h后，水蒸氣蒸餾40 min，按1.3.1中的方法提取八角茴香油，考察物料粉碎度對(duì)八角茴香油提取效果的影響。

八角茴香油的提取率隨著物料粉碎程度的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，0.20～0.30 mm（篩孔徑）粉碎度的八角粉末提取八角茴香油效果最佳，此后，再增加物料粉碎程度，提取率下降。這可能是因?yàn)?，物料粉碎程度增加，有利于八角茴香油的溶出，但是，物料粉碎程度過大時(shí)，容易造成物料之間的粘連，不利于八角茴香油的提取。因此，選擇0.20～0.30 mm（篩孔徑）為水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油的物料最佳粉碎度，0.15～0.20，0.20～0.30，0.30～0.45 mm作為正交試驗(yàn)水平。

2.4 水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油的正交試驗(yàn)

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以八角茴香油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油的最佳工藝條件，因素及水平見表1，結(jié)果見表2。

由表2可知，水蒸氣蒸餾法從八角茴香果實(shí)中提取八角茴香油的最佳工藝條件為：A2B3C3，即料液比1∶20 g·mL-1，蒸餾時(shí)間50 min，八角果實(shí)物料粉碎度0.30～0.45 mm（篩孔徑）。極差分析表明，影響八角茴香油提取率的因素次序?yàn)椋篈>B>C，即料液比>蒸餾時(shí)間>八角果實(shí)粉碎度。

2.4.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)最佳提取工藝條件進(jìn)行5次驗(yàn)證。結(jié)果表明，八角茴香油平均提取率為14.657%，相對(duì)平均偏差RSD為0.032%，說明此最佳提取工藝條件穩(wěn)定、正確。筆者采用水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油的提取率高于李瑞紅等[13]（10.87%，水蒸氣蒸餾法）和王同禹等[9]（7.58%，水蒸氣蒸餾法）報(bào)道的結(jié)果，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)采用了蒸餾前浸泡36 h，增加了八角油溶出效果，也與八角果實(shí)來源、蒸餾工藝條件和萃取所用溶劑存在差異有關(guān)。

2.5 八角茴香油的抑菌活性分析

采用濾紙片法測(cè)定八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分（即八角茴香油）及水溶性組分對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

從表3可以看出，水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有一定的抑菌效果，對(duì)枯草芽孢桿菌（革蘭氏陽性菌）的抑制效果好于大腸桿菌（革蘭氏陰性菌），這與WANG等[14]的研究結(jié)果一致;八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分的抑菌效果優(yōu)于水溶性組分，且抑菌活性隨樣品濃度的增加而增大。八角茴香揮發(fā)性成分的抑菌活性與其主要成分反式茴香腦密切相關(guān)[15]。此外，水蒸氣蒸餾提取八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分（八角茴香油）之后，通常會(huì)把燒瓶中剩余的澄清溶液（水溶性組分）棄掉。但從表3中的數(shù)據(jù)可知，濃度為1 000.0 mg·mL-1的水溶性組分對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌仍然具有一定的抑制效果，抑菌圈直徑分別達(dá)到10.20±0.20 mm和10.95±0.29 mm，屬于中等程度的敏感[16]。因此，在提取八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分同時(shí)，還應(yīng)該繼續(xù)收集并利用水溶性組分，實(shí)現(xiàn)八角茴香揮發(fā)性成分的綜合利用。

3 結(jié)論與討論

據(jù)報(bào)道，水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油外觀品質(zhì)好，抑菌活性強(qiáng)，作為植物源抗菌劑用于食品保鮮和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。萃取溶劑、物料粉末浸泡時(shí)間、料液比、蒸餾時(shí)間和物料粉碎度均可對(duì)水蒸氣蒸餾法提取八角果實(shí)中的八角茴香油產(chǎn)生一定程度的影響。

本試驗(yàn)結(jié)合單因素和L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)料液比、蒸餾時(shí)間和物料粉碎度的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其最佳組合為料液比1∶20 g·mL-1，水蒸氣蒸餾時(shí)間50 min，八角果實(shí)粉碎度0.30～0.45 mm（篩孔徑），以石油醚（30～60 ℃），作為萃取溶劑，提前將八角粉末浸泡36 h，在此條件下八角茴香油提取率可達(dá)14.657%，其中影響八角茴香油提取率的因素次序?yàn)榱弦罕?gt;蒸餾時(shí)間>八角果實(shí)粉碎度。

本試驗(yàn)對(duì)提取的八角茴香油抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定，其對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌，且抑菌效果隨著濃度的增加而增大;八角茴香揮發(fā)性成分的油相部分（八角茴香油）的抑菌效果優(yōu)于水溶性組分，但濃度為1 000.0 mg·mL-1的水溶性組分對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果仍屬于中度敏感，故在提取八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分的同時(shí)，應(yīng)該繼續(xù)收集并利用水溶性組分，實(shí)現(xiàn)八角茴香揮發(fā)性成分的綜合利用。

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