李春霞 吳建金 黃亮 孫寧 王玉 班立桐

摘? ? 要：不同菌種對(duì)液體培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率不同，試驗(yàn)以香菇0912作為供試菌株，以菌絲體干質(zhì)量為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究了不同碳氮源、無(wú)機(jī)鹽含量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH、靜置時(shí)間以及培養(yǎng)基裝液量對(duì)香菇菌絲干質(zhì)量的影響，結(jié)果表明最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為玉米漿，K2HPO4的最佳用量為0.1%，KH2PO4 的最佳用量為0.1%，初始pH值 5.0，裝液量為50 mL，培養(yǎng)溫度為25 ℃，靜置時(shí)間為24 h，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。在此基礎(chǔ)上，對(duì)液體培養(yǎng)基的組分含量進(jìn)行了L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果表明4個(gè)因素對(duì)香菇菌絲干質(zhì)量的影響表現(xiàn)為：葡萄糖>玉米漿>KH2PO4>K2HPO4，其中葡萄糖和玉米漿的含量對(duì)菌絲干質(zhì)量具有極顯著影響（P<0.01），并確定了香菇0912菌株液體深層發(fā)酵各組分的優(yōu)水平為葡萄糖3%，玉米漿0.3%，K2HPO4 0.05%，KH2PO4 0.05%，搭配MgSO4 0.05 %，維生素B1 0.005%，在此條件下，菌絲干質(zhì)量達(dá)到2.103 g·L-1，是優(yōu)化前（1.417 g·L-1）的1.49倍。

關(guān)鍵詞：香菇;液體菌種;培養(yǎng)基篩選;搖瓶發(fā)酵

中圖分類號(hào)：S646.1+2? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.02.001

Abstract： The utilization efficiency of nutrients in liquid medium was different among different strains. In the study， Lentinus edodes 0912 was used as the tested strain. The optimal carbon and nitrogen sources， inorganic salt content， rotational speed and initial pH of culture medium， and also the standing time and medium volume were screened through the single factor experiment， and the dry weight of mycelia was as the evaluation index. The results showed that the best carbon source was glucose， the best nitrogen source was corn pulp， the best amount of K2HPO4 and KH2PO4 was both 0.1%， the initial pH was 5.0， the liquid medium volume was 50 mL， the culture temperature was 25 ℃， the rest time was 24 h and the speed was 180 r·min-1. On the basis， the composition of liquid medium was tested by L9（34） orthogonal test. The results showed that the effects of four factors on the dry weight of L. edodes were glucose > corn pulp > KH2PO4 >K2HPO4， in which the content of glucose and corn pulp had a significant effect on the dry weight of mycelium（P<0.01）， and the optimum conditions for liquid deep fermentation of L. edodes strain 0912 were glucose 3%， corn pulp 0.3%， K2HPO4 0.05%， KH2PO4 0.05%， matched with MgSO4 0.05% and VB1 0.005%， the dry weight of mycelium could reach 2.103 g·L-1， which was 1.49 times of that before optimization （1.417 g·L-1）.

Key words：? L. edodes; liquid strain; culture medium screening; fermentation by shaking flask

香菇（Lentinus edodes）俗稱花菇、冬菇，是擔(dān)子菌綱傘形科真菌，在闊葉性原木上生長(zhǎng)較為廣泛，被稱為“山珍之王”[1-6]。香菇中蛋白質(zhì)種類繁多，必需氨基酸占有2/3的比例，能夠增強(qiáng)體質(zhì)，促進(jìn)機(jī)體發(fā)育[7]。香菇多糖（β-D-葡聚糖），具有免疫調(diào)控、健胃、助消化、抑制微生物感染、抗病毒感染、抗腫瘤和抵抗癌癥等生物活性[8]。

2016年我國(guó)的食用菌產(chǎn)量達(dá)3 596.7萬(wàn)t，成為繼菜、糧、果、油之后的第五大農(nóng)作物，而香菇產(chǎn)量為898.3萬(wàn)t，為我國(guó)食用菌中產(chǎn)量第一的品種。香菇生產(chǎn)主要為袋栽模式，產(chǎn)地包括古田、慶元、磐安等老產(chǎn)區(qū)及西峽、平泉、岫巖等新產(chǎn)區(qū)。

香菇0912是撫順市農(nóng)科院雜交技術(shù)選育而成的優(yōu)質(zhì)香菇新品種，具有出菇早、菌絲潔白濃密、抗雜性好、菌棒堅(jiān)實(shí)，高溫季節(jié)出菇質(zhì)量好，是遼寧地區(qū)香菇的主栽品種[9-10]，經(jīng)過(guò)天津市蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及相關(guān)農(nóng)技人員的推廣，目前在天津市薊州區(qū)栽培面積不斷擴(kuò)大，但主要以農(nóng)戶栽培為主，采用的均為固體菌種。香菇固體菌種有成本高、易受雜菌污染、出菇周期長(zhǎng)、工作強(qiáng)度大等缺點(diǎn)[11]。使用液體深層發(fā)酵技術(shù)制備香菇菌種，并使用該菌種栽培香菇，是香菇高效生產(chǎn)的一種新途徑。液體培養(yǎng)具有周期短、流動(dòng)快、菌絲及其代謝產(chǎn)物較多等優(yōu)點(diǎn)，而且從其發(fā)酵液中提取的有效成分具有保健和藥用功能[12]。液體培養(yǎng)基配方的優(yōu)良對(duì)香菇菌絲及其代謝產(chǎn)物的形成至關(guān)重要，合適的碳氮源及其比例、無(wú)機(jī)鹽的用量、培養(yǎng)條件對(duì)液體培養(yǎng)過(guò)程中菌絲的生長(zhǎng)有很大影響，在液體發(fā)酵過(guò)程，營(yíng)養(yǎng)菌絲在適當(dāng)?shù)臈l件下生長(zhǎng)更快，新陳代謝更加旺盛。王穎等[13]以抽濾后的菌絲生物量作為指標(biāo)，對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后測(cè)得菌絲生物量（干質(zhì)量）為56.292 g·L-1。

在相同環(huán)境下，不同菌種對(duì)液體培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率不同，金衛(wèi)群等[14]以杏鮑菇的3種不同菌株為研究對(duì)象，結(jié)果表明不同菌株的出菇量以及生物學(xué)轉(zhuǎn)化率具有明顯差異。本研究對(duì)香菇0912菌株的液體培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為該菌株液體菌種在栽培過(guò)程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

香菇0912菌株;天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)系食用菌研發(fā)中心斜面保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基： PDA培養(yǎng)基;

發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖2%、玉米漿0.2%、K2HPO4 0.1%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.05%、維生素B1 0.005 %。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌絲生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中的第4～11天取樣，過(guò)濾、烘干，計(jì)算菌絲干質(zhì)量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲干質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制菌絲生長(zhǎng)曲線圖，并根據(jù)生長(zhǎng)曲線圖確定取樣時(shí)間。

1.3.2 培養(yǎng)基碳源、氮源篩選 （1）在基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下，分別以玉米漿、麩皮、蛋白胨、酵母粉作為氮源，含量均為0.2%，5組重復(fù)，測(cè)定菌絲體的干質(zhì)量， 確定最佳氮源。

（2）以玉米漿為氮源，分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、土豆粉作為碳源，含量均為2%，5組重復(fù)，在第10天取樣，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，篩選出最佳碳源。

1.3.3 碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽添加量的篩選 （1）在基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下，設(shè)置玉米漿添加水平為0.2%，0.3%，0.4%，培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，確定最佳添加量。

（2）在氮源添加量為0.3%的條件下，設(shè)置葡萄糖的添加水平為2%，3%，4%，培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，確定最佳添加量。

（3）在氮源添加量為0.3%、碳源添加量為3%的條件下，設(shè)置K2HPO4的添加水平為0.05%，0.10%，0.15%，培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，確定最佳添加量。

（4）在氮源添加量為0.3%、碳源添加量為3%、K2HPO4添加量為0.10%的條件下，設(shè)置KH2PO4的添加水平為0.05%，0.10%，0.15%，培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，確定最佳添加量。

1.3.4 菌種培養(yǎng)條件篩選? ? （1）在優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)速梯度為120，150，180，210 r·min-1，培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，確定最佳轉(zhuǎn)速。

（2）在優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的條件下，設(shè)置不同裝液量梯度，裝液量依次為50，70，90，110 mL，培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲體的干質(zhì)量，確定最佳裝液量。

（3）在優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，裝液量為50 mL的條件下，設(shè)定靜置時(shí)間梯度為12，24，36，48 h，培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，確定最佳靜置時(shí)間。

（4）在優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，裝液量為50 mL，靜置時(shí)間為24 h的條件下，設(shè)置不同pH值梯度，依次為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，確定最佳pH值。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定葡萄糖、玉米漿作為香菇菌絲液體培養(yǎng)的碳源和氮源，K2HPO4、KH2PO4為培養(yǎng)基中主要的無(wú)機(jī)鹽成分，并在篩選K2HPO4、KH2PO4添加量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以葡萄糖、玉米漿、K2HPO4、KH2PO4為研究因素，在初始pH值為5.0，裝液量為50 mL，靜置時(shí)間為24 h，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的條件下培養(yǎng)，設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。根據(jù)菌絲生長(zhǎng)曲線確定培養(yǎng)10 d時(shí)，并測(cè)定菌絲干質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS軟件對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較分析及正交試驗(yàn)的方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇菌絲生長(zhǎng)曲線

香菇菌絲生長(zhǎng)情況，菌絲干質(zhì)量在培養(yǎng)過(guò)程中呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)的前3 d有萌發(fā)現(xiàn)象，在接種的菌塊表面有少量絨毛狀菌絲，第4～8天，菌絲開始緩慢生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中出現(xiàn)少量菌絲和較小的菌球，第8～9天，菌絲生長(zhǎng)達(dá)到快速生長(zhǎng)期，培養(yǎng)基中的菌球數(shù)量明顯增多，菌球變大，至第10天，菌絲體干質(zhì)量達(dá)到最大為1.417 g·L-1，第11天菌絲干質(zhì)量開始下降，因此，根據(jù)香菇0912菌絲生長(zhǎng)曲線確定最佳取樣時(shí)間為第10天。

2.2 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2.1 不同氮源 有機(jī)氮源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可作為菌絲生長(zhǎng)中合成氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等代謝過(guò)程中的重要物質(zhì)的來(lái)源[15]。含玉米漿的液體培養(yǎng)基中菌絲干質(zhì)量最大為1.108 g·L-1，表明香菇0912菌絲對(duì)玉米漿的利用能力最強(qiáng)，麩皮次之，對(duì)蛋白胨和酵母粉的利用能力最差，但各處理間差異均未達(dá)顯著水平（數(shù)據(jù)未列出），故篩選出的最佳氮源為玉米漿。

2.2.2 不同碳源 香菇0912菌絲對(duì)葡萄糖的利用能力最強(qiáng)，菌絲干質(zhì)量為1.245 g·L-1，顯著高于使用土豆粉、蔗糖、淀粉作為碳源的菌絲干質(zhì)量，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)情況，適合香菇0912菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源為葡萄糖，這與覃寶山等[16]對(duì)碳源篩選的結(jié)果一致。

2.3 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同添加量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3.1? ? 氮源添加量? ? 在玉米漿添加水平為0.2%，0.3%，0.4%的條件下，菌絲干質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，且在玉米漿添加量為0.3%時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大為1.12 g·L-1，顯著高于0.2%和0.4%處理。

2.3.2? ? 碳源添加量? ? 在葡萄糖添加水平為2%，3%，4%的條件下，菌絲干質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，且在葡萄糖添加量為3%時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大為1.009 g·L-1，顯著高于2%和4%處理。

2.3.3 K2HPO4添加量 在K2HPO4添加水平為0.05%，0.10%，0.15%的條件下，菌絲干質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，且在K2HPO4添加量為0.10%時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大為0.769 g·L-1，顯著高于0.05%和0.15%處理。

2.3.4 KH2PO4添加量? ? 在KH2PO4添加水平為0.05%，0.10%，0.15%的條件下，菌絲干質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，且在KH2PO4添加量為0.10%時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大為0.874 g·L-1，顯著高于0.05%和0.15%處理，后二者之間表現(xiàn)為0.15%處理顯著高于0.05%處理。

2.4 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

轉(zhuǎn)速越高，搖瓶中的溶氧量越多，越有利于菌絲的生長(zhǎng);但轉(zhuǎn)速過(guò)高會(huì)產(chǎn)生較大的剪切力，在培養(yǎng)過(guò)程中不能夠形成菌球，進(jìn)而影響菌絲生長(zhǎng)[17]。隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，搖瓶中溶氧量逐漸增加，但菌絲干質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的條件下，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大為1.187 g·L-1，但處理間差異均未達(dá)顯著水平（數(shù)據(jù)未列出），根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選出的最佳轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。? ? 2.5 不同裝液量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

搖瓶裝液量越大，搖瓶中溶氧量反而降低，菌絲干質(zhì)量也降低，當(dāng)裝液量為50 mL時(shí)，搖瓶中溶氧量高，菌絲生長(zhǎng)較快，代謝旺盛，菌絲干質(zhì)量最大為1.221 g·L-1，顯著高于其他各處理，故最佳裝液量為50 mL。

2.6 不同靜置時(shí)間對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

隨著靜置時(shí)間的增加，菌絲干質(zhì)量先增加后降低，靜置時(shí)間為24 h的搖瓶中菌絲干質(zhì)量最大為1.501 g·L-1，但各處理間差異均未達(dá)顯著水平（數(shù)據(jù)未列出），根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定靜置時(shí)間為24 h是適合香菇0912菌株生長(zhǎng)的最佳條件，這與覃寶山等[16]的研究結(jié)果確定的最佳靜置時(shí)間為42 h不同，其差異性可能是由于菌種和所采用的液體培養(yǎng)基成分的不同引起的。

2.7 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

pH值的高低影響細(xì)胞膜的電荷變化，酶活性以及菌絲生物量也會(huì)受該因素影響較大[18]。隨著pH值的增加，菌絲干質(zhì)量基本上呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，pH值為5.0時(shí)菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大為1.534 g·L-1，顯著高于其他pH處理，pH值為8.0時(shí)搖瓶中菌絲基本沒(méi)有生長(zhǎng)，故篩選出的最佳pH值為5.0，這與馬瓊等[19]對(duì)香菇培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果一致。

2.8 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2可知，在不同的培養(yǎng)基組分下，搖瓶中香菇0912菌絲干質(zhì)量以A3B3C2D1處理最大，為1.883 g·L-1;根據(jù)極差分析結(jié)果，影響菌絲干質(zhì)量的各因素的主次順序?yàn)椋浩咸烟?gt;玉米漿>KH2PO4>K2HPO4，方差分析結(jié)果（表3）表明，葡萄糖和玉米漿的影響均達(dá)極顯著水平，而KH2PO4和K2HPO4均未達(dá)顯著水平;根據(jù)正交試驗(yàn)篩選出適合香菇0912菌絲液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合為A3B3C1D1，這與9個(gè)處理中最大值組合A3B3C2D1不一致;經(jīng)驗(yàn)證，在組合A3B3C1D1的條件下培養(yǎng)，香菇0912菌絲干質(zhì)量達(dá)到2.103 g·L-1，優(yōu)于A3B3C2D1，即適合香菇0912菌株生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖3%，玉米漿0.3%，K2HPO4 0.05%，KH2PO4 0.05%。

3 結(jié)論與討論

碳源和氮源是菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中最主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌絲不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)條件下的生長(zhǎng)速率以及在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物含量不同，聶建軍等[20]研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖時(shí)，菌絲生物量和胞外多糖產(chǎn)量均明顯高于蔗糖，分別提高了5.83和0.85倍。因此，篩選合適的碳氮源在提高香菇菌絲產(chǎn)量上十分重要。魏雅冬等[12]認(rèn)為香菇對(duì)葡萄糖的利用效果較差，菌絲生物量最低，而在本試驗(yàn)中，香菇0912菌株對(duì)速效碳源—葡萄糖的利用效果最好，這可能是由于菌株不同，其對(duì)葡萄糖的利用效果亦存在差異;土豆粉的營(yíng)養(yǎng)成分含量較多，同樣適于菌絲生長(zhǎng);香菇菌絲對(duì)蔗糖的利用速率較慢，其原因有待于進(jìn)一步研究;淀粉在高溫滅菌后需要被水解方可被利用，菌絲對(duì)淀粉的利用速率最差?？傮w來(lái)看，試驗(yàn)中所采用的氮源均適合香菇0912菌絲的生長(zhǎng)，但對(duì)玉米漿和麥麩的利用效率最高，考慮到麥麩會(huì)對(duì)菌絲干質(zhì)量的結(jié)果造成誤差，故選用玉米漿為最佳氮源。pH值篩選結(jié)果表明香菇0912菌絲液體培養(yǎng)的最佳pH值為5，與徐思煒等[21]的研究結(jié)果一致。

將單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合，最終篩選出的適合香菇0912的液體培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件為：葡萄糖3%，玉米漿0.3 %，K2HPO4 0.05 %，KH2PO4 0.05%，MgSO4 0.05%，維生素B1 0.005%，pH值5.0，裝液量50 mL，接種量為直徑5 mm的菌塊3塊，培養(yǎng)溫度25? ℃，靜置時(shí)間24 h，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，在此條件下菌絲干質(zhì)量達(dá)到2.103 g·L-1，是優(yōu)化前（1.417 g·L-1）的1.49倍。

在規(guī)?；a(chǎn)中，液體菌種的培養(yǎng)主要靠發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)，本試驗(yàn)通過(guò)搖瓶培養(yǎng)確定了可參考的香菇0912菌株培養(yǎng)基，而發(fā)酵罐和搖瓶的培養(yǎng)控制差異較大，其優(yōu)化還有待在發(fā)酵罐中進(jìn)一步開展試驗(yàn)研究。

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