胡 巍 劉 娜 王譯凡 李 影 賀琦多 郭 斌

糖尿病是以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，由胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起，分為1型、2型、妊娠型及其他如基因缺陷等少數(shù)特殊型糖尿病，而其中2型糖尿病最為常見，占比超過90%。2型糖尿病以胰島素分泌相對不足為特征，可表現(xiàn)為胰島素抵抗綜合征[1]。長期進展的糖尿病會導(dǎo)致多組織器官如眼部、腎臟、骨組織、心血管系統(tǒng)等的慢性損害和功能障礙，其并發(fā)癥嚴重影響身體健康[2,3]。

骨形成與骨吸收活動的動態(tài)平衡維持了骨組織的正常生長及代謝活動，失衡引起骨組織硬化、骨質(zhì)疏松及退化吸收等骨疾病。臨床及體外細胞學實驗表明，1型糖尿病和2型糖尿病均可增加骨折風險及干擾骨愈合[4]，且1型糖尿病主要干擾骨形成代謝過程而非骨吸收代謝過程，對成骨進程的相關(guān)細胞可表現(xiàn)出抑制作用[5]。然而目前關(guān)于2型糖尿病對體內(nèi)長骨骨組織結(jié)構(gòu)和骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells,BMSCs)的影響研究鮮少展開。本研究擬建立2型糖尿病大鼠模型，分析2型糖尿病對長骨形態(tài)參數(shù)以及對骨髓間充質(zhì)干細胞生物學功能的影響，為防治2型糖尿病引起的骨損傷疾病提供依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 健康清潔SPF級雄性GK大鼠和雄性Wistar大鼠各8只，6周齡，體質(zhì)量GK大鼠138.5±17.1g，Wistar大鼠161.3±15.9g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，動物合格證號：201723853。

1.1.2 主要試劑與儀器 α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco，美國)，青霉素/鏈霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化液(HyClone公司，美國)，超敏感大鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒(Mercodia，瑞典)，BCIP/NBT底物顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、Cell Counting Kit-8試劑盒、DNA含量檢測試劑盒(細胞周期)，Trizol reagent RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)、PrimeScriptTM RT Reagent Kit(TaKaRa， 日 本 )， TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物科技有限公司)，β-甘油磷酸鈉、L-維生素C、地塞米松(Sigma，美國)，GEeXploreLocusMicroCT掃描機(美國通用公司)，羅氏ACCU-CHEKR Advantage血糖儀(Roche，瑞士)，BD FACS流式細胞儀(BD，美國)，CFX96實時定量PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型 采用GK大鼠純食物誘導(dǎo)方法構(gòu)建2型糖尿病模型。自6周齡至14周齡，8只GK組大鼠作為實驗組，輔以高脂飼料喂養(yǎng)；8只Wistar大鼠作為對照組，輔以普通飼料喂養(yǎng)。每周于固定時間禁食、不禁水12h后進行生理指標測定，包括體重、空腹血糖，使用羅氏ACCU-CHEKR Advantage血糖儀測定大鼠尾靜脈血血糖值。大鼠至14周齡夜間禁食、不禁水12h后，檢測各組空腹胰島素，再進行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)。胰島素測定時采血自大鼠內(nèi)眥靜脈，應(yīng)用超敏感大鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測空腹胰島素值。口服葡萄糖耐量試驗給予50%葡萄糖溶液4.2g/kg灌胃，分別在空腹時、糖負荷30min、60min和120min后于尾靜脈采血并測定血糖值。2型糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功的標準：空腹血糖值≥11.1mmol/L或OGTT實驗120min后血糖大于16.7mmol/L。

1.2.2 顯微CT掃描脛骨結(jié)構(gòu)形態(tài)計量學指標選取建模成功的兩組GK組大鼠和Wistar組大鼠各8只，注射戊巴比妥鈉處死大鼠，解剖雙側(cè)股骨和脛骨。咬骨鉗去除股骨兩端骨質(zhì)，暴露骨髓腔，利用干細胞培養(yǎng)液沖洗出骨髓，并置于37℃、5%CO2及飽和濕度的環(huán)境進行細胞培養(yǎng)；脛骨放置于多聚甲醛固定液固定24h后，采用美國通用公司GE eXplore Locus MicroCT掃描機(voltage 80V，current 450μA，bin mode 1×127μm)對脛骨近端骨骺端進行連續(xù)斷層掃描。

1.2.3 細胞純化 待原代細胞匯合至80%時，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成細胞懸液，再加入等量細胞培養(yǎng)液終止反應(yīng)，1000r/min離心5min，棄上清后加入細胞培養(yǎng)液重懸細胞，應(yīng)用有限稀釋法培養(yǎng)BMSCs。調(diào)整細胞密度至1.5×104/mL，向96孔板每孔中加入0.1mL細胞懸液，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后標記單個細胞孔，補加0.1mL細胞培養(yǎng)基，3日換液一次，待克隆細胞長至96孔板底匯合至60%時，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化、擴大培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力 取第三代生長良好的各組骨髓間充質(zhì)干細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成細胞懸液。稀釋細胞懸液，細胞計數(shù)后以5×104/ml濃度的懸液按照100μL/孔接種至96孔板，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)，分別在1d、2d、3d、4d、5d后向每孔加入10μL CCK-8溶液，用酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度。

1.2.5 細胞凋亡檢測試驗與細胞周期檢測試驗收集各組第三代骨髓間充質(zhì)干細胞1×106/次，用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒中的Binding Buffer懸浮并重懸細胞使細胞密度達到1×106/ml，每管加入100μL細胞，再向管中加入5μL Annexin V-FITC，再加入 5μL PI溶液孵育5min，最后每管加入PBS溶液至500μL，流式細胞儀上機檢測；調(diào)整第三代骨髓間充質(zhì)干細胞細胞濃度為1×106/ml，取1ml單細胞懸液，離心單細胞懸液，去除上清液，在細胞中加入70%預(yù)冷乙醇500μL，固定2小時4℃保存至過夜，在細胞沉淀中加100μL RNaseA溶液，37℃水浴30min，加入400μL PI染色液混勻孵育30min，流式細胞儀進行上機檢測，記錄激發(fā)波長488nm處紅色熒光。

1.2.6 ALP染色檢測成骨誘導(dǎo)分化能力 收集各組第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞計數(shù)后以3×105/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)細胞匯合至60%時更換為細胞成骨分化培養(yǎng)基分別培養(yǎng)7天，每3日換液一次。7d后倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs復(fù)層生長并出現(xiàn)圓形結(jié)節(jié)，棄培養(yǎng)液并沖洗，多聚甲醛固定細胞20min后，應(yīng)用BCIP/NBT底物顯色試劑盒，染色20min后流水沖洗，倒置顯微鏡下拍照。

1.2.7 實時定量PCR檢測 Trizol提取各組第3代BMSCs常規(guī)培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)7d的RNA，應(yīng)用微量紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。應(yīng)用PrimeScript RT reagent Kit進行cDNA合成，按照使用說明在20μL反轉(zhuǎn)錄體系中進行，總反應(yīng)體系為：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，qPCR SuperMix 10μL，cDNA 1μL，ddH2O 8μL。參照NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，采用Primer primer 5.0軟件設(shè)計目的基因上下游引物，由華大基因公司合成引物。采用CFX96實時定量PCR儀進行檢測，PCR擴增反應(yīng)條件：95℃3min；95℃10s，55.5℃30s，35個循環(huán)。

表1 目的基因的引物序列

1.2.8 統(tǒng)計學分析 各個試驗重復(fù)三次，定量結(jié)果數(shù)據(jù)以)表示。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件采用t檢驗和單因素方差分析對試驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行分析，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2.結(jié)果

2.1 2型糖尿病大鼠模型建模的確定 6至14周，GK組大鼠體重增長較Wistar組緩慢，且有隨著生長周齡增加兩組大鼠體重差異逐漸擴大的趨勢(圖1A)。14周齡的GK組大鼠有多飲、多尿的表現(xiàn)，GK組大鼠的空腹血糖值14.61±5.31顯著高于Wistar組的空腹血糖值6.24±0.54(圖1B)。GK組大鼠內(nèi)眥靜脈血的空腹胰島素含量值0.81±0.14顯著高于Wistar組(圖1C)。OGTT口服葡萄糖耐量試驗結(jié)果顯示GK組大鼠血糖波動幅度較Wistar組大，60min的血糖值達到最高值，120min后Wistar組大鼠血糖值6.4±0.3降至約初始水平，GK組大鼠血糖值22.3±2.1則較初始水平顯著上升(圖1D)。所有GK組大鼠生理指標都滿足空腹血糖值≥11.1mmol/L或OGTT實驗120min后血糖大于16.7mmol/L的標準，均建模成功。

圖1 大鼠糖尿病生化指標檢測試驗

2.2 2型糖尿病對脛骨骨形態(tài)計量分析的影響顯微CT掃描兩組大鼠脛骨形態(tài)計量分析的結(jié)果見(表2)。GK糖尿病組大鼠脛骨長度顯著低于Wistar對照組，結(jié)構(gòu)模型指數(shù)SMI顯著高于Wistar對照組，而骨礦物質(zhì)密度BMD、骨小梁厚度Tb.Th、骨小梁間距Tb.Sp及骨體積分數(shù)BV/TV在兩組間均無明顯差異。雖然GK糖尿病組結(jié)構(gòu)模型指數(shù)SMI值顯著增加顯示可能有骨質(zhì)疏松傾向，但綜合骨礦物質(zhì)密度BMD、骨小梁厚度Tb.Th、骨小梁間距Tb.Sp及骨體積分數(shù)BV/TV數(shù)值說明2型糖尿病尚未顯著引起骨質(zhì)疏松樣改變。

表2 大鼠脛骨顯微CT骨形態(tài)計量分析，n=8)

表2 大鼠脛骨顯微CT骨形態(tài)計量分析，n=8)

*：P＜0.05

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2.3 2型糖尿病對BMSCs增殖和凋亡活性的影響 與對照組Wistar BMSCs流式細胞周期結(jié)果比較，GK組BMSCs在2型糖尿病微環(huán)境中，G1期細胞百分數(shù)93.38±0.69%顯著高于Wistar組86.72±1.64%，S期細胞百分數(shù)2.60±0.46%，G2期細胞百分數(shù)4.05±0.31%，都顯著低于對照組，表明2型糖尿病微環(huán)境對GK組BMSCs具有G1期阻滯作用(圖2A，表3)。應(yīng)用流式細胞儀檢測兩組BMSCs細胞凋亡，兩組BMSCs均只有少量細胞凋亡，GK組BMSCs早期凋亡2.01±0.61%，晚期凋亡11.74±1.47%，凋亡率顯著比Wistar對照組高(圖2B，表4)。

CCK-8試驗結(jié)果顯示，兩組BMSCs在第一天和第二天吸光度值未見明顯差異，但第三天開始Wistar組吸光度值顯著高于GK組(圖3)。GK組細胞生長曲線較平緩，從第三天開始Wistar組BMSCs細胞逐漸步入對數(shù)生長期，且擴增能力顯著強于GK組BMSCs。

結(jié)合增殖和凋亡試驗表明，2型糖尿病微環(huán)境對BMSCs具有抑制增殖活性、促進細胞凋亡的作用。

圖2A 流式細胞儀檢測BMSCs細胞周期

圖2B 流式細胞儀檢測BMSCs細胞凋亡

表3 2型糖尿病對BMSCs細胞周期的影響(%)

表4 2型糖尿病對BMSCs細胞凋亡的影響(%)

圖3 CCK-8試驗(*：P＜0.05)

2.4 2型糖尿病抑制BMSCs成骨分化能力 兩組BMSCs經(jīng)過7d成骨誘導(dǎo)后，鏡下可見GK組和Wistar組BMSCs都形成眾多圓形結(jié)節(jié)，Wistar組圓形結(jié)節(jié)更大、數(shù)更多量。ALP染色結(jié)果表明，6孔板中Wistar組較GK組染色更深、著色密度更大。鏡下見ALP染色呈藍色，圍繞圓形結(jié)節(jié)區(qū)域，呈條狀或團狀，GK組染色區(qū)域較稀疏(圖4-圖5)。

兩組BMSCs經(jīng)過7d成骨誘導(dǎo)后，采用qRTPCR對GK組和Wistar組BMSCs成骨分化誘導(dǎo)前后的早期及晚期成骨標志基因表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：成骨誘導(dǎo)前，GK組BMSCs的成骨基因OPN、ALP、Runx2 mRNA表達量(0.14±0.04，0.45±0.13，0.50±0.12)低于 Wistar組(0.29±0.04，0.70±0.08，0.78±0.16)；成骨誘導(dǎo)后，GK組BMSCs的成骨基因OPN、ALP、Runx2mRNA表達量(0.34±0.08，0.64±0.11，0.83±0.08)都較成骨誘導(dǎo)前顯著增加，但都低于Wistar組(0.82±0.10，1.47±0.06，1.21±0.04)，二者差異具有統(tǒng)計學意義。晚期成骨標志物OSX雖然在成骨誘導(dǎo)前兩組間無明顯差異，但成骨誘導(dǎo)后GK組OSX mRNA表達量0.68±0.05顯著低于Wistar對照組0.88±0.04(圖 6)。

圖4 BMSCs ALP染色平皿肉眼觀

圖5 BMSCs ALP染色倒置顯微鏡下觀

圖6 BMSCs成骨標志基因表達(OS:成骨誘導(dǎo)；*：P＜0.05)

圖7 BMSCs促炎因子基因表達(*：P＜0.05)

該定性和定量的結(jié)果提示，2型糖尿病微環(huán)境下調(diào)BMSCs早期及晚期成骨標志基因的表達，抑制BMSCs的成骨分化能力。

2.5 2 型糖尿病對 IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP9促炎因子表達的影響 應(yīng)用qRT-PCR對GK組和Wistar組BMSCs的促炎因子基因表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GK組BMSCs的成骨基因IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 表達量(0.11±0.03，0.07±0.01，0.14±0.03)高于 Wistar組(0.05±0.01，0.02±0.01，0.07±0.02)，而 MMP9 mRNA表達量在兩組間無顯著差異(圖7)。IL-1β、IL-6及TNF-α與炎癥的發(fā)生及進展關(guān)系密切，該結(jié)果說明2型糖尿病上調(diào)BMSCs部分促炎因子的表達，可能引起B(yǎng)MSCs炎癥微環(huán)境從而影響其成骨活性。

2.6 2型糖尿病對caspase-3、caspase-8凋亡因子表達的影響 應(yīng)用qRT-PCR對GK組和Wistar組BMSCs的凋亡因子基因表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GK組BMSCs的凋亡因子caspase-3、caspase-8 mRNA表達量在GK組顯著增高，表達量分別為0.27±0.03、0.18±0.03，高于Wistar對照組0.18±0.04、0.14±0.01，P＜0.05。該結(jié)果與之前流式細胞儀檢測的細胞凋亡趨勢一致，表明2型糖尿病促進BMSCs凋亡活性。

圖7 BMSCs凋亡因子caspase3、caspase8基因表達(*：P＜0.05)

3.討論

1型糖尿病和2型糖尿病均增高骨折風險、干擾骨形成及損傷骨愈合。1型糖尿病為胰島素依賴型糖尿病，在1型糖尿病患者和動物模型中，骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density,BMD)指數(shù)降低，骨小梁數(shù)量減少，骨髓脂肪組織增多[6]。1型糖尿病大鼠的高糖狀態(tài)使得Nfic等成骨相關(guān)基因表達下降，成骨標記產(chǎn)物降低[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)1型糖尿病使腰椎骨折風險增高1.3-2.3倍，股骨頸部骨折風險增高約2.6倍，橈骨遠端骨折風險增高約1.8倍[8]。2型糖尿病為非胰島素依賴型糖尿病，大多研究也認為2型糖尿病增加骨折風險。而有研究表明2型糖尿病影響骨代謝活動與時間相關(guān)，初始階段的胰島素抵抗正性影響骨組織，而長期進展的2型糖尿病則損傷骨代謝活動。也有臨床研究發(fā)現(xiàn)新確診的2型糖尿病骨折風險與正常人群無明顯差異，而有5年及以上病史2型糖尿病人群的骨折風險顯著上升[9-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠模型骨礦物質(zhì)密度BMD指數(shù)與對照組無顯著差異，這與之前部分研究結(jié)論一致，但也有學者指出BMD指數(shù)并未能完全反映骨量變化。通過計算機斷層掃描研究2型糖尿病患者髖關(guān)節(jié)和脊柱，證明2型糖尿病患者具有相似的小梁容積密度，而骨量和橫截面積顯著降低[12,13]。本研究通過顯微CT掃描結(jié)果證實2型糖尿病GK大鼠模型的脛骨長度降低、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)增高。而理論上發(fā)生骨質(zhì)疏松時，骨小梁從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，結(jié)構(gòu)模型指數(shù)增加、骨小梁厚度值減少、骨小梁間距值增加，更多本研究其他的數(shù)據(jù)包括BMD、骨小梁厚度、骨小梁間距及骨體積分數(shù)數(shù)值并無顯著差異，說明14周內(nèi)2型糖尿病尚未顯著引起骨質(zhì)疏松樣改變。值得一提的是，Burghard等[14]學者發(fā)現(xiàn)在骨小梁區(qū)域，部分高骨密度面積補償了2型糖尿病受試者中較低的骨密度面積受試者，從而維持骨小梁整體正常的壓縮骨強度；相反，在骨皮質(zhì)區(qū)域，骨骼面積較小，受試者未被高骨密度面積補償，導(dǎo)致骨質(zhì)下降、彎曲強度和皮質(zhì)骨脆性增加，這些發(fā)現(xiàn)可能有助于解釋2型糖尿病患者髖關(guān)節(jié)和其他易骨折部位骨折風險增高的現(xiàn)象。有學者[15]報告1型糖尿病患者骨量減少和骨質(zhì)疏松發(fā)病率為48%～72%，2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病率可達20%～60%。糖尿病相關(guān)的細胞因子、生長因子、信號通路在問充質(zhì)干細胞的分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，共同導(dǎo)致糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。由于本研究可能構(gòu)建2型糖尿病GK模型時間較短，骨計量形態(tài)學參數(shù)是否會隨著糖尿病進展而發(fā)生更明顯的變化，未來需要進一步探究。

骨髓間充質(zhì)干細胞一直是骨再生醫(yī)學的熱點，其具備良好的增殖能力、多向分化能力，是理想的再生醫(yī)學種子細胞，對于骨形成活動及更新具有重要意義。本研究結(jié)果表明2型糖尿病促進BMSCs凋亡活性、抑制BMSCs的增殖能力和成骨分化能力，抑制骨形成代謝活動。同時，2型糖尿病上調(diào)促炎因子白介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的表達，表明 2 型糖尿病引起B(yǎng)MSCs炎癥微環(huán)境。有學者[16]研究也發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠頜骨來源的BMSCs的成骨分化能力受到損害。臨床研究[17]報告2型糖尿病患者血樣品中骨鈣素(osteocalcin,OCN)含量降低，且與IL-6及C反應(yīng)蛋白含量呈負相關(guān)。也有研究表明患有牙周炎的人群也具有顯著增加的TNF-α、IL-1β和IL-6水平[18,19]，炎癥延長并伴有脂質(zhì)過氧化增加[20]。Pacios等[21]學者指出2型糖尿病使成骨細胞OCN表達降低，腫瘤壞死因子水平增加，而使用腫瘤壞死因子抑制劑可以部分恢復(fù)成骨相關(guān)因子的表達。腫瘤壞死因子還限制下調(diào)其他炎癥因子表達的能力，增加核因子-κB活性，從而激活核因子 κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號通路，導(dǎo)致成骨細胞fra-1和Runx2基因表達減少，抑制成骨分化能力[22,23]。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病也增加caspase-3凋亡相關(guān)基因的表達，促進細胞凋亡的發(fā)生[24]，本研究結(jié)果也驗證了這一趨勢，但炎癥介質(zhì)影響骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖分化更多具體機制尚需進一步探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病GK大鼠模型短期內(nèi)未使長骨發(fā)生顯著骨質(zhì)疏松樣改變；2型糖尿病抑制骨髓間充質(zhì)干細胞增殖活性及成骨分化能力，上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細胞部分促炎因子和凋亡因子的表達。該結(jié)果提示，2型糖尿病引起的炎癥微環(huán)境可能是抑制骨形成代謝的原因之一，研究抑制或逆轉(zhuǎn)炎性介質(zhì)作用或成為調(diào)控恢復(fù)2型糖尿病微環(huán)境下的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨活性的新思路。