吳 萍，李佳佳，裴新茹，陳 坤，胡汪來

(安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室，安徽 合肥 230032)

Bcl-2家族蛋白是線粒體凋亡途徑重要的調(diào)控者，其中抗凋亡蛋白包括B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma，Bcl-2)、B細胞淋巴瘤超大蛋白(B-cell lymphoma extra large，Bcl-xL)、髓樣細胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)、Bcl-w和A1。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白高表達是腫瘤細胞生存及耐藥的重要機制之一，因此，抑制抗凋亡蛋白能達到殺傷腫瘤細胞的目的。“BH3-only”蛋白是天然的抗凋亡蛋白的抑制劑，但很難通過現(xiàn)有技術(shù)直接得到，因此，人們用模擬“BH3-only”蛋白的小分子化合物來抑制抗凋亡蛋白，由此誕生了BH3類似物(BH3 mimetics)的概念。自2005年以來，BH3類似物成為腫瘤研究領(lǐng)域的新熱點，大量的小分子化合物不斷涌現(xiàn)，如抑制Bcl-2/Bcl-xL的ABT-737及其口服衍生物ABT-263、抑制Bcl-2的ABT-199等。對于那些依賴Bcl-2和/或Bcl-xL存活的腫瘤細胞而言，這些BH3類似物的效果很好，但一些腫瘤細胞由于高表達Mcl-1而對它們抵抗[1]，因此，研發(fā)出能選擇性抑制Mcl-1的BH3類似物很有必要。UMI-77是2014年通過高通量篩選方法鑒定出來的Mcl-1小分子抑制劑，在胰腺癌的體內(nèi)和體外實驗中都有很好的效果[2]。本研究將UMI-77應(yīng)用到胃癌細胞，在對UMI-77抵抗的胃癌細胞中，將UMI-77和Bcl-2/Bcl-xL的抑制劑ABT-737聯(lián)用，觀察聯(lián)用后的細胞凋亡情況，并探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司；胎牛血清，購自Hyclone公司；UMI-77、ABT-737，購自Selleck公司；MTS購自Promega公司；FITC Annexin V 凋亡檢測試劑盒，購自BD Pharmingen公司；MitoProbe JC-1試劑盒，購自Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；抗pro-caspase-3、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly [ADP-ribose] polymerase-1，PARP-1)、Survivin、Bcl-2和Mcl-1單克隆抗體，購自Santa Cruz公司；抗cleaved-caspase-3、caspase-9、X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、細胞凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP1)、cIAP2、Bcl-xL、Bim、p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)單克隆抗體，購自Cell Signaling公司；抗NOXA單克隆抗體，購自Abcam公司；抗GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器 全自動酶標儀(Bio Tek公司)；流式細胞儀(BD公司)；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀(Bio-Rad公司)；全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon公司)；倒置相差顯微鏡(Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞MGC-803、HGC-27，購自中國科學院上海細胞庫。細胞用含體積分數(shù)為0.10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTS法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期的細胞，以適當密度接種于96孔板(每孔100 μL)，次日細胞匯合度達70%，加入不同濃度的UMI-77、ABT-737或同時加入UMI-77和ABT-737，對照組加入含有與藥物組同等含量的DMSO，調(diào)零孔僅加等體積的培養(yǎng)液、無細胞，每組設(shè)6個復(fù)孔。處理48 h或24 h后，每孔加10 μL MTS，37 ℃避光孵育1～4 h，在酶標儀上檢測主波長為490 nm、參考波長為630 nm處的吸光度(OD)值，計算細胞存活率：細胞存活率/%=(實驗組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照組OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.2.3Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的HGC-27細胞，以適當密度接種于24孔板，次日細胞匯合度達70%，分別加UMI-77(10 μmol·L-1)、ABT-737(10 μmol·L-1)、UMI-77(10 μmol·L-1)+ABT-737(10 μmol·L-1)處理，對照組(Control)加入含有與處理組同等含量的DMSO，每組設(shè)3個復(fù)孔。24 h后，分別收集孔中的上清至流式管中，貼壁的細胞用不含EDTA的胰酶消化下來，也收集到對應(yīng)的流式管中。用冷PBS洗2次，每管細胞沉淀中加100 μL 1×binding buffer，充分吹打混勻。每管加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光染色15 min，最后每管加400 μL 1×binding buffer，立即上流式細胞儀檢測細胞凋亡，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析結(jié)果，以Annexin V(+)細胞所占比例定為細胞凋亡率。

1.2.4JC-1染色流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位(Δψm)的變化 種板、處理及收集步驟同“1.2.3”，每管細胞沉淀中加1 mL溫PBS重懸，陽性對照管加1 μL 50 mmol·L-1的碳酰氰基-對-氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)(終濃度為50 μmol·L-1)，37 ℃避光處理5 min。然后每管加2.5 μL 200 μmol·L-1的JC-1(終濃度為0.5 μmol·L-1)，37 ℃避光染色30 min。每管加2 mL 溫PBS洗1次，最后每管加500 μL溫PBS重懸，立即上流式細胞儀檢測ΔΨm的變化情況。FlowJo 7.6軟件分析結(jié)果，當ΔΨm較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光。當ΔΨm較低時，JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。

1.2.5Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達 收集對照組(Control)、UMI-77(10 μmol·L-1)、ABT-737(10 μmol·L-1)、UMI-77(10 μmol·L-1)+ABT-737(10 μmol·L-1)處理24 h的細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、14 000×g離心30 min后，取上清，即細胞總蛋白。采用BCA法蛋白定量，取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE，隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含50 g·L-1脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜；次日用TBST洗3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。ECL顯色，在化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中曝光成像。應(yīng)用Image J軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1HGC-27細胞對UMI-77不敏感用UMI-77(1、2、5、10、20、50 μmol·L-1)處理MGC-803和HGC-27細胞48 h，MTS法檢測細胞存活率。Fig 1結(jié)果顯示，MGC-803細胞對UMI-77很敏感，隨著UMI-77濃度升高，細胞存活率逐漸降低，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性；而HGC-27細胞對UMI-77抵抗，20 μmol·L-1以下的濃度幾乎對細胞存活無影響，只有在濃度高達50 μmol·L-1時，細胞才大量死亡。

Fig 1 Effect of UMI-77 on viability of gastric cancer MGC-803 and HGC-27 cells n=6)

**P<0.01vscontrol

2.2UMI-77和ABT-737聯(lián)用能明顯增加HGC-27細胞死亡在對UMI-77不敏感的HGC-27細胞中，分別將UMI-77(1、2、5、10 μmol·L-1)與10 μmol·L-1的ABT-737聯(lián)用24 h，MTS法檢測細胞存活率。如Fig 2A所示，10 μmol·L-1的ABT-737與UMI-77(1、2、5、10 μmol·L-1)聯(lián)用時，能明顯降低細胞存活率，與單用UMI-77或單用ABT-737相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。進一步采用Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，如Fig 2B所示，10 μmol·L-1UMI-77與10 μmol·L-1ABT-737聯(lián)用24 h后，Annexin V (+)細胞所占的比例明顯增多，且其中大部分死細胞都位于右下象限，說明確實發(fā)生了凋亡。

2.3UMI-77和ABT-737聯(lián)用激活了線粒體凋亡途徑JC-1染色流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位(ΔΨm)的變化，F(xiàn)ig 3A結(jié)果顯示，10 μmol·L-1UMI-77或10 μmol·L-1ABT-737單獨處理24 h時Δψm較高，JC-1大多處于聚合狀態(tài)，而UMI-77和ABT-737聯(lián)用后Δψm急劇下降。Western blot結(jié)果顯示(Fig 3B)，UMI-77單用時caspases不激活，ABT-737單用時，caspases有一定程度的活化，但UMI-77和ABT-737聯(lián)用后，caspase-9、caspase-3和PARP-1的裂解更加明顯，表現(xiàn)為pro-caspase-9、pro-caspase-3和PARP-1的表達水平降低，同時cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP-1出現(xiàn)，說明UMI-77和ABT-737聯(lián)用是通過線粒體途徑導致HGC-27細胞發(fā)生凋亡。

2.4IAP家族和Bcl-2家族在UMI-77和ABT-737聯(lián)用中的作用Western blot檢測IAP家族和Bcl-2家族在單用或聯(lián)用UMI-77與ABT-737前后的表達情況，如Fig 4所示，IAP家族中的XIAP、cIAP1和cIAP2在UMI-77與ABT-737聯(lián)用時下降，其中以XIAP和cIAP2的下降尤為明顯，Survivin的表達沒有變化；“BH3-only”蛋白中的NOXA明顯增高，PUMA明顯降低，抗凋亡蛋白中的Bcl-2略有升高、Mcl-1略有下降，但變化的程度很有限，而Bcl-xL和Bim沒有任何改變。

3 討論

以Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白為靶點設(shè)計的小分子抑制劑，被稱為BH3類似物，是一類新的抗腫瘤制劑，目前，研究得較為清楚的是ABT-737、ABT-263、ABT-199等。ABT-737和ABT-263在體內(nèi)和體外實驗中都具有很好的抗腫瘤活性，已進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗階段。ABT-199在2016年4月經(jīng)美國FDA批準已經(jīng)上市，用于染色體17p缺失的慢性淋巴細胞白血病的治療，是第1個進入臨床的BH3類似物，這一具有里程碑意義的事件，極大地激發(fā)了人們研究BH3類似物的熱情。

Fig 2 Effect of treatment with UMI-77 plus ABT-737 on cell death in HGC-27 cells n=6)

A: Cell viability after treatment with UMI-77, ABT-737 alone or combination for 24 h; B: Apoptotic rate after treatment with UMI-77 plus ABT-737 for 24 h.**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs 10 μmol·L-1UMI-77;△△P<0.01 vs 10 μmol·L-1ABT-737.

Mcl-1是抗凋亡蛋白里比較獨特的成員，它只含有Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域1～3(Bcl-2 homology domain，BH1～3)，盡管如此，它的分子量卻最大，由350個氨基酸殘基組成。其氨基端含有2個脯氨酸/谷氨酸/絲氨酸/蘇氨酸(proline/glutamic acid/serine/threonine，PEST)序列，使得Mcl-1半衰期很短(<1～4 h)。Mcl-1在多種腫瘤中高表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和不良預(yù)后相關(guān)[3]。利用基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)翻譯的抑制劑[4]或RNA干擾[5]辦法下調(diào)Mcl-1，能增加腫瘤細胞對化療藥物或BH3類似物(ABT-737、ABT-199等)的敏感性，因此，研發(fā)出能特異性抑制Mcl-1的BH3類似物很有必要。

Fig 3 Effect of combination of UMI-77 with ABT-737 on mitochondrial membrane potential and caspases activation n=3)

A: Effect on the mitochondrial membrane potential using JC-1 staining by flow cytometry; B: Activation of caspase-9, caspase-3 and PARP-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 4 Effect of treatment with UMI-77, ABT-737, either alone or in combination, on expression levels of IAP family and Bcl-2 family members n=3)**P<0.01 vs control

與針對Bcl-2和Bcl-xL的抑制劑相比，Mcl-1抑制劑的研究稍顯滯后，最近幾年才陸續(xù)出現(xiàn)幾個選擇性針對Mcl-1的小分子抑制劑，如Maritoclax[6]、UMI-77、A-1210477[7]和S63845[8]。UMI-77是2014年Abulwerdi等[2]鑒定出的一種選擇性的Mcl-1抑制劑，能與Mcl-1的BH3結(jié)合槽結(jié)合，阻止Mcl-1/Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)和Mcl-1/Bcl-2同源拮抗者(Bcl-2 homologous antagonist killer，Bak)復(fù)合物形成，經(jīng)線粒體途徑誘導胰腺癌細胞發(fā)生凋亡。在胰腺癌異種移植物重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠模型中，UMI-77也顯示出很強的抗腫瘤活性，且對周圍組織無毒性。此外，UMI-77能增強胰腺癌細胞對放療的敏感性[9]，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[10]和食管鱗癌[11]中，將UMI-77與TRAIL或順鉑聯(lián)用也能誘導更明顯的細胞凋亡。

本研究將UMI-77作用于兩株胃癌細胞，發(fā)現(xiàn)MGC-803細胞對之很敏感，單獨使用就可以達到很好的效果，而HGC-27細胞對之抵抗，因此，如何克服HGC-27細胞對UMI-77的抵抗就是本研究的重點。HGC-27細胞對低濃度的ABT-737也不太敏感，但是當UMI-77和ABT-737聯(lián)用后，細胞存活率明顯下降，超過一半的細胞表現(xiàn)為Annexin V(+)，且其中的絕大多數(shù)位于右下象限，說明細胞確實發(fā)生了凋亡。此外，前體形式的pro-caspase-9、pro-caspase-3和PARP-1明顯減少，與之相伴著裂解形式的cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3及cleaved-PARP-1出現(xiàn)，說明caspases級聯(lián)反應(yīng)被激活；線粒體膜電位的下降，說明線粒體參與了細胞凋亡過程，這些都充分證實UMI-77和ABT-737聯(lián)用是通過線粒體途徑誘導HGC-27細胞發(fā)生凋亡。

為了了解凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白在UMI-77和ABT-737聯(lián)用中的作用，觀察Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)、“BH3-only”蛋白(Bim、PUMA、NOXA)，以及IAP家族中的XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin的表達水平，發(fā)現(xiàn)XIAP、cIAP1和cIAP2在聯(lián)用時明顯下調(diào)。IAP家族是一組內(nèi)源性的抑制細胞凋亡的蛋白，包括XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin等8個成員。XIAP能直接結(jié)合到caspase-9、caspase-7和caspase-3上，從而抑制它們的活性，而凋亡發(fā)生時，從線粒體釋放出來的第2個線粒體來源的caspases激活劑(second mitochondria-derived activator of caspases，SMAC)能解除XIAP對caspases的抑制。cIAP1和cIAP2能以高親和力結(jié)合SMAC，阻止SMAC對XIAP的抑制作用，從而間接地抑制caspases。越來越多的證據(jù)表明，IAP家族在多種腫瘤細胞中高表達，其下調(diào)或失活會引起凋亡的增加[12]，本研究中，XIAP、cIAP1和cIAP2的下降可能正是導致凋亡增加的關(guān)鍵因素?？沟蛲龅鞍譈cl-2升高和Mcl-1降低的程度很有限，而“BH3-only”蛋白NOXA的上調(diào)和PUMA的下調(diào)卻十分明顯?！癇H3-only”蛋白啟動凋亡是通過直接激活Bax/Bak，或者抑制抗凋亡蛋白的作用來達成。如Bim、PUMA能抑制Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1，而NOXA只能抑制Mcl-1[13]?？沟蛲龅鞍滓种频蛲鲋饕峭ㄟ^隔離“BH3-only”蛋白，或者阻止Bax/Bak發(fā)生同源寡聚化。在本研究中，“BH3-only”蛋白與抗凋亡蛋白之間究竟有著怎樣復(fù)雜的相互作用尚不清楚，可能是NOXA的增加抑制了Mcl-1，另外，Bcl-2的增加又導致了PUMA的下降，這些問題還需要今后進一步深入的研究。

綜上所述，不同的胃癌細胞對Mcl-1小分子抑制劑UMI-77的敏感性不同，對于那些對UMI-77抵抗的細胞，可以通過與Bcl-2/Bcl-xL抑制劑ABT-737聯(lián)用的方式來增強殺傷效應(yīng)，兩者聯(lián)用能更有效地激活線粒體凋亡途徑。本研究的結(jié)果將有望拓展Mcl-1小分子抑制劑在更多實體腫瘤中的應(yīng)用，為此類抑制劑最終進入臨床提供理論依據(jù)。