黃 雪，王 穎，張 慧，趙 萌,2,*，方亞鵬,2

（1.湖北工業(yè)大學 菲利普斯親水膠體研究中心，湖北省食品膠體國際科技合作基地，湖北 武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

核殼結構是一種較為理想的微膠囊載體形式，質地堅硬，對消化液、水分等具有較低的滲透性，可減少外界因素對包埋物的傷害，有利于包埋物的保護和貯存，文獻中常見的核殼結構體系有海藻酸鈉/殼聚糖[1-3]、海藻酸鈉/聚乙烯醇[4]、聚環(huán)氧乙烷/殼聚糖[5]、葡聚糖/β-伴大豆球蛋白[6]、聚丙烯酸酯/環(huán)氧改性聚氨酯等[7-8]。玉米醇溶蛋白（Zein）是一種強疏水性蛋白，溶于高體積分數(shù)乙醇水溶液、不溶于水[9-11]。在70%乙醇溶液中，Zein的α-螺旋結構含量在50%～60%左右，隨著乙醇體積分數(shù)的降低，α-螺旋逐步轉變?yōu)棣?折疊，在疏水作用下反向排列、形成長帶狀結構，進而卷曲成圓盤層狀結構，最終自組裝成納米、微米顆粒結構[12-13]。依據(jù)這一特性，可采用反溶劑法荷載活性成分，即將溶于高體積分數(shù)乙醇的Zein/活性組分混合物，加入水溶液中，高速剪切，形成水不溶性顆粒[14]。目前，該法包埋的活性成分有魚油[15]、精油[16-17]、亞麻油[18]、槲皮素[19-20]、柚皮素[21]、番茄紅素[22]以及溶菌酶[23]等。該法制備的活性顆粒多為納米級，存在荷載組分種類有限、收集困難、荷載量小等問題[21,24]。Filippidi等[25]報道中鏈甘油三酯（mediumchain triglyceride，MCT）/Zein核殼結構微膠囊的反溶劑制備法，分別以MCT和60%乙醇的Zein溶液為油相和水相，高速剪切制備O/W乳液，緩慢加水，通過Zein在油滴表面凝聚而形成微膠囊，最后旋蒸、去除多余乙醇。該核殼結構微膠囊的粒徑大小為20～100 μm，壁厚為（4.0±0.7）μm，在模擬胃液和膽鹽中可保持較為完整的結構，抑制了脂肪水解速率。

Filippidi等[25]的Zein反溶劑法制備活性組分微膠囊，一定程度上改善了荷載組分種類有限、收集困難、荷載量小等問題，但仍比較局限，特別是需要旋蒸濃縮收集微膠囊，大大影響了包埋物活性及揮發(fā)性包埋物包埋率。本研究通過降低剪切速率增大微膠囊尺寸，在Zein向油滴沉淀的過程中，向水相中添加阿拉伯膠（gum arabic，GA），通過GA和Zein的相互作用[26-27]，降低微膠囊的成團和掛壁現(xiàn)象，后通過離心收集MCT/Zein微米微膠囊。本實驗中微膠囊制備方法簡單易行，特別是離心收集避免了旋蒸對包埋物的不利影響，適用于多種油溶性活性組分的包埋和保護。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白 北京百靈威科技有限公司；中鏈甘油三酯 馬來西亞KLK公司；GA 日本San-Ei Gen公司；無水乙醇、吐溫80 國藥集團化學試劑有限公司；尼羅藍A 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；BT-1600百特圖像顆粒分布儀分析系統(tǒng) 日本電子株式會社；Direct Q3型超純水機 美國默克密理博公司；EL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BT100LC恒流泵 保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司；機械攪拌器 德國IKA公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；FV12000MPE激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司；JSM6390LV掃描電鏡 日本Jeol公司。

1.3 方法

1.3.1 MCT/Zein微膠囊載體的制備

反溶劑法制備MCT/Zein核殼結構微膠囊主要參照文獻[25]的方法，并在此基礎上有所改進：1）配制100 mL體積分數(shù)為60%的乙醇溶液，添加一定量的乳化劑；2）將Zein加入到該乙醇溶液中，室溫條件下300 r/min攪拌30 min至完全溶解，配制成質量濃度4 g/100 mL的Zein溶液；3）向100 mL質量濃度4 g/100 mL的Zein溶液中加入5 mL MCT；4）37 ℃水浴，在一定速率下機械攪拌5 min形成乳液；5）保持轉速300 r/min，用恒流泵以一定速率滴加定量水相，使Zein沉積；6）室溫靜置后離心收集下層沉淀，即得到微膠囊載體，冷凍干燥后得到凍干粉。通過掃描電鏡和激光共聚焦以及凍干后樣品重懸的粒徑分布考察微膠囊載體的穩(wěn)定性。在實驗優(yōu)化過程中，采用單一因子變量法，控制其他條件不變，改變?nèi)榛瘎╊愋停o乳化劑、吐溫80、GA）、乳化劑質量分數(shù)（體積分數(shù)60%的乙醇溶液為基準的0%、0.25%、0.5%、1%質量分數(shù)的GA）、乳化速率（300、500、800 r/min）、Zein沉淀溶液（130 mL水、100 mL水＋30 mL GA溶液、70 mL水＋60 mL GA溶液、30 mL水＋100 mL GA溶液，其中GA質量分數(shù)為1%）、Zein沉淀溶液加入速率（3、6、9、12 mL/min），研究不同實驗條件對MCT/Zein微膠囊載體形態(tài)的影響。

1.3.2 宏觀形態(tài)觀察

分別從3 個角度對樣品進行拍照：樣品制備，靜置1 h，1）對靜置沉積的MCT/Zein微膠囊載體混合物側面進行拍照，記為體系側面圖；2）俯視角度，對微膠囊載體混合物的表面出油情況進行拍照，記為體系上方圖；3）傾倒出上清液，俯視角度對底部收集的MCT/Zein微膠囊載體進行拍照，記為沉淀上方圖。通過體系側面圖和體系上方圖判斷樣品包埋出油情況，通過沉淀上方圖直觀表示微膠囊整體外觀情況。

1.3.3 光學顯微鏡觀察

采用BT-1600圖像顆粒分析系統(tǒng)監(jiān)測微膠囊載體形態(tài)。取少量濕態(tài)微膠囊載體滴加于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

將導電膠貼在樣品臺表面，將少量凍干后的樣品粉末平鋪在導電膠上，吹去多余的粉末，通過噴金處理增加樣品導電性，以10 kV的加速電壓，在調節(jié)樣品和探頭的距離后使用掃描電子顯微鏡在200 倍和1 000 倍條件下進行觀察。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡觀察

將凍干粉重懸水溶液中混勻，加入尼羅藍染色液（質量分數(shù)1%的溶液），充分混合后置于背光處染色。將染色后的微膠囊載體滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。對尼羅藍分別采用488 nm和633 nm的激發(fā)線以及500～600 nm和640～750 nm的發(fā)射帶通，在488 nm激發(fā)線下檢測油相，在633 nm激發(fā)線下檢測蛋白質，獲取樣品的共聚焦顯微鏡圖像。

1.3.6 粒徑分布測定

粒徑分布通過Marstersizer 2000激光粒度儀測定。將待測樣品等效為一個球體，根據(jù)大顆粒散射角小，小顆粒散射角大的激光衍射基本原理，設置多個角度的檢測器，通過檢測器檢測到的散射光的光強大小計算粒徑大小及分布。使用超純水作為分散劑，其折光率為1.33，將樣品折射率設定為1.52，吸收率為0.1，泵轉速為2 000 r/min，將微膠囊載體溶液逐滴加入分散劑中，通過Hydro 2000MU型濕法進樣器進樣進行測定。微膠囊載體的粒徑分布以顆粒粒徑的對數(shù)坐標為橫坐標，該粒徑下的顆粒所占體積分數(shù)為縱坐標所繪制。微膠囊載體的平均粒徑用D[4,3]表示，代表體積加權平均值，粒徑分布寬度用Span表示，當Span為1時，粒徑分布呈對稱分布。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進行分析。微米載體的共聚焦顯微鏡圖像使用Olympus圖像軟件處理，合并兩種不同激發(fā)線下的共聚焦顯微鏡圖像而成。

2 結果與分析

2.1 乳化劑類型對微膠囊載體形態(tài)的影響

乳化劑類型對MCT/Zein微膠囊載體宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)的影響結果見圖1。由圖1a1～c1可知，3 組樣品宏觀出油情況差異不大；但在微觀形態(tài)圖1a2～c2中，乳化劑為GA的微膠囊形態(tài)較好且油脂包埋均勻，當乳化劑為吐溫80和不使用乳化劑時，微膠囊形態(tài)較差、不能完整包埋油。另外，由圖2的粒徑分布也可看出，乳化劑為GA時，顆粒呈單峰分布，尺寸均一。因而，以GA為乳化劑制備油/Zein微膠囊載體效果最好。

在MCT/Zein微膠囊載體制備過程中，GA乳化效果遠高于吐溫80。主要是因為GA是大分子乳化劑，為帶負電多糖，和Zein具有一定的靜電作用及空間位阻穩(wěn)定作用，能防止油/Zein顆粒的聚集粘壁現(xiàn)象。Chen Huaiqiong等[28]發(fā)現(xiàn)GA可以穩(wěn)定Zein的納米顆粒，在pH 3.0～8.0范圍內(nèi)能阻止Zein顆粒的聚集，作用機理為靜電和疏水相互作用促使GA在Zein表面的吸附。因此，選擇GA作為乳化劑進行后續(xù)實驗。

圖1 不同乳化劑制備的MCT/Zein微膠囊載體宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)Fig. 1 Macro-morphological and micro-morphological features of MCT/zein microcapsules preared with different emulsifiers

圖2 不同乳化劑制備的MCT/Zein微膠囊載體的粒徑分布Fig. 2 Size distribution of MCT/zein microcapsules prepared with different emulsifiers

2.2 乳化劑質量分數(shù)對微膠囊載體形態(tài)的影響

由圖3a1～d1右上圖可知，a1～c1組樣品宏觀出油情況差異不大，但d1組樣品表面出油嚴重，表明在該質量分數(shù)下油相未被完全包埋；由a1～d1右下圖可以看出，b1～d1組收集的微膠囊無明顯差異，但a1組微膠囊明顯出油，說明在該質量分數(shù)下微膠囊間存在聚集現(xiàn)象，導致表面出油；在微觀形態(tài)圖3a2～d2中也可以看出：GA質量分數(shù)在0%和0.25%時，呈現(xiàn)為明顯的多核結構，微膠囊間聚集造成樣品出油；1% GA時，微膠囊尺寸過?。?.5% GA時，微膠囊形態(tài)較好且油滴包埋均勻。圖4的粒徑分布也表明，0.5% GA時，微膠囊呈單峰分布，尺寸均一。因此，0.5% GA時制備的MCT/Zein微膠囊載體效果最好。

乳化劑質量分數(shù)過高或過低均不利于MCT/Zein微膠囊載體的制備。當GA質量分數(shù)較低時，乳化能力不足，不能完全穩(wěn)定油相，導致乳化后油滴進一步聚集，形成多核、大尺寸結構，而當GA質量分數(shù)過高時，GA和Zein之間相互作用增強，GA和油滴之間發(fā)生競爭作用，導致大部分油滴沒有被Zein完整沉積包埋。因而，選擇0.5%GA為乳化劑進行后續(xù)實驗。

圖3 不同GA質量分數(shù)下的MCT/Zein微膠囊載體宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)Fig. 3 Macro-morphological and micro-morphological features of MCT/zein microcapsules with different GA concentrations

圖4 不同GA質量分數(shù)下的MCT/Zein微膠囊載體粒徑分布Fig. 4 Size distribution pro files of MCT/zein microcapsules with different GA concentrations

2.3 乳化速率對微膠囊載體形態(tài)的影響

在制備MCT/Zein微膠囊載體過程中，乳化速率作為關鍵因素不僅會影響微膠囊的形態(tài)和粒徑，對于微膠囊的穩(wěn)定性也有一定的影響。一般來說，乳化速率越大，微膠囊粒徑越小，越趨于穩(wěn)定。考慮到乳化速率對微膠囊尺寸和包埋物活性的影響，本實驗在300～800 r/min范圍內(nèi)進行優(yōu)化。由圖5a1～c1可知，低乳化速率（300、500 r/min）條件下，樣品宏觀出油情況嚴重，800 r/min的乳化速率可使微膠囊有效包埋油脂。由微觀形態(tài)和粒徑分布表明，3 組樣品形態(tài)和粒徑差異不大（圖5a2～c2、圖6）。前期實驗中，當乳化速率為300 r/min時，不論采用何種乳化劑，所制備的樣品均出油嚴重，因而，乳化速率在包埋油相的過程中尤為重要。在控制微膠囊尺寸的條件下，考慮到800 r/min能夠增強油滴的穩(wěn)定性，且對大多活性組分損傷較小，故選擇乳化速率為800 r/min進行后續(xù)實驗。

圖5 不同乳化速率下的MCT/Zein微膠囊載體宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)Fig. 5 Macro-morphology and micro-morphology of MCT/zein microcapsules prepared with different emulsification speeds

圖6 不同乳化速率制備的MCT/Zein微膠囊載體的粒徑分布Fig. 6 Size distribution of MCT/zein microcapsules prepared with different emulsification speeds

2.4 Zein沉淀溶液對微膠囊載體形態(tài)的影響

圖7 不同Zein沉淀溶液制備的MCT/Zein微膠囊載體宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)Fig. 7 Macro-morphological and micro-morphological features of MCT/zein microcapsules prepared with different zein precipitation solutions

本實驗制備的微膠囊尺寸較大，極易聚集，在前期實驗中，采用單純加水沉積Zein會使微膠囊聚集成團且掛壁嚴重。文獻報道，陰離子多糖甜菜果膠可通過靜電作用和空間位阻作用穩(wěn)定Zein膠體顆粒[29]，在薄荷油/Zein納米微膠囊中加入GA溶液也具有很好的穩(wěn)定效果[28]。因而，本實驗采用同時加水和加分散穩(wěn)定劑GA溶液的方式來沉積Zein，并穩(wěn)定MCT/Zein微膠囊載體。圖7為不同Zein沉淀溶液對MCT/zein微膠囊載體的宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)的影響：圖7c1和圖7c2顯示“30 mL水＋100 mL GA溶液”的沉淀溶液對油脂宏觀包埋效果最好且微膠囊表面沒有出油現(xiàn)象，微膠囊微觀形態(tài)較好且大小均一；其他加水方式均存在油脂包埋效果差、出油等問題。圖8同樣可以看出，沉淀溶液“30 mL水＋100 mL GA溶液”的微膠囊載體粒徑跨越系數(shù)最小，粒徑最為均一。

圖8 不同Zein沉淀溶液制備的MCT/Zein微膠囊載體的粒徑分布Fig. 8 Size distribution of MCT/zein microcapsules prepared with different zein precipitation solutions

當沉淀溶液為“130 mL水”和“60 mL水＋70 mL GA溶液”時，微膠囊呈現(xiàn)多核結構主要是因為在Zein沉積過程中穩(wěn)定劑不足導致油滴部分聚集在一起；當沉淀溶液為“130 mL GA溶液”時，GA和Zein之間相互作用明顯增強，GA的競爭作用使得Zein不能很好地包埋油滴；當沉淀溶液為“30 mL水＋100 mL GA溶液”時，適量的穩(wěn)定劑在不影響油滴包埋效果下很好地防止了油滴聚集。綜上所述，選擇Zein沉淀溶液為“30 mL水＋100 mL GA溶液”進行后續(xù)實驗。

2.5 Zein沉淀溶液加入速率對微膠囊載體形態(tài)的影響

圖9 Zein沉淀溶液不同加入速率下制備的MCT/Zein微膠囊載體宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)Fig. 9 Macro-morphological and micro-morphological features of MCT/zein microcapsules prepared at different addition rates of zein precipitation solution

圖10 Zein沉淀溶液不同加入速率制備的MCT/Zein微膠囊載體的粒徑分布Fig. 10 Size distribution profiles of MCT/zein microcapsules prepared at different addition rates of zein precipitation solution

在MCT/Zein微膠囊載體制備過程中，Zein沉淀溶液加入速率明顯影響微膠囊的粒徑。Filippidi等[25]采用緩慢加水的方法，制備了20～100 μm的微膠囊顆粒。本實驗以微膠囊宏觀形態(tài)、微觀形態(tài)和粒徑分布特性為指標，優(yōu)化Zein沉淀溶液加入速率。溶液加入速率對MCT/Zein微膠囊載體宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)的影響（圖9）表明，Zein沉淀溶液加入速率并沒有造成樣品的宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)的顯著差異；由圖10可以看出，當加入速率為3 mL/min和6 mL/min時，微膠囊均呈現(xiàn)為單峰分布，粒徑分布較窄，當加入速率為9 mL/min和12 mL/min時，微膠囊呈現(xiàn)為多峰分布，分布略寬。實驗結果表明，隨著沉淀溶液加入速率的增大，微膠囊粒徑分布變廣，大小不再均一，這可能是由于加入速率的增加，Zein不僅在油滴表面沉積，其本身在水相也會沉積，從而使得微膠囊呈現(xiàn)出多峰分布。綜合考慮制備時間長短和微膠囊粒徑形態(tài)，選擇Zein沉淀溶液加入速率為6 mL/min進行后續(xù)實驗。

2.6 MCT/Zein微膠囊載體的制備及表征

圖11a、b顯示MCT/Zein微膠囊載體具有良好的核殼結構，凍干后微膠囊核殼結構保持完好、未塌陷。經(jīng)尼羅藍染色，MCT/Zein微膠囊載體的油相和蛋白相在CLSM下呈綠色和紅色，兩者顏色疊加后顯示為橙色；由圖11c可以看出，Zein分布在核殼結構微膠囊的表面，將油滴很好地包埋在微膠囊中。圖12為微膠囊凍干后重懸的粒徑分布圖，MCT/Zein微膠囊載體凍干重懸后的平均粒徑為（49.86±2.27）μm，粒徑跨越系數(shù)為1.032±0.01。另外，需要說明的是，MCT/Zein微膠囊載體貯藏穩(wěn)定性好，低溫貯藏30 d，沒有表面出油現(xiàn)象。

圖11 凍干MCT/Zein微膠囊載體的掃描電鏡圖（a、b）和激光共聚焦圖（c）Fig. 11 SEM (a and b) and CLSM observation (c) of freeze dried MCT/zein microcapsules

圖12 凍干MCT/Zein微膠囊載體的粒徑分布Fig. 12 Size distribution profiles of freeze dried MCT/zein microcapsules

綜上所述，MCT/Zein微膠囊載體凍干復溶后核殼結構依舊保持較好的形態(tài)，且粒徑均一，具有良好的復溶穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。掃描電鏡圖和激光共聚焦圖顯示出微膠囊呈多核結構，即Zein并不是均勻沉積在MCT油滴表面，這可能是Zein包裹小粒徑油滴后又再次沉積在較大油滴表面。Filippidi等[25]制備的MCT/Zein微膠囊為單核的核殼結構，這主要是制備方法不同造成的。Filippidi等[25]采用4 500 r/min的乳化速率，以旋蒸方式促進乙醇快速揮發(fā)，Zein在油滴表面均勻析出，形成了較好的單核結構；而本法中乳化速率較小，且在沉積過程中采用緩慢加水和GA溶液的方式沉積Zein，并未旋蒸，因此造成MCT/Zein微膠囊在結構上存在較大差異。

3 結 論

本實驗采用水相反溶劑法成功構建了MCT/Zein微膠囊載體的核殼結構，通過考察微膠囊載體宏觀、微觀形態(tài)以及粒徑大小與分布情況，對MCT/Zein微膠囊載體的制備工藝進行優(yōu)化，當乳化劑為0.5% GA、乳化速率800 r/min、Zein沉淀溶液為“30 mL水＋100 mL GA溶液”、Zein沉淀溶液加入速率6 mL/min時，成功制備出了粒徑均一、穩(wěn)定性良好、具有典型核殼結構的MCT/Zein微膠囊載體。本制備方法的優(yōu)點為：1）簡單易行；2）油相選擇性多，如MCT、植物油、動物油、脂肪酸等；3）適用于多種油溶性活性組分的包埋和保護研究：金槍魚油、藍薊油等動物性油組分，香草油、薄荷油、薰衣草油等精油組分，姜黃素、蝦青素、番茄紅素等油溶性色素組分，VA、VD2、VE等脂溶性維生素組分。另外，制備過程中所用組分均為天然高分子，符合食品微膠囊“天然綠色”的發(fā)展趨勢。