王玉玉 顏天銘 孔 永 沈立軍 王 婧 周慧君 邱玉華

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系，蘇州215123)

CD86分子(又稱B7-2分子)是表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC) 包括巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)等表面的協(xié)同刺激分子[1，2]，其能夠與T細(xì)胞表面CD28分子結(jié)合，作為T細(xì)胞活化的第二信號(hào)[3，4]，促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖及發(fā)揮功能。CD86分子是目前所公認(rèn)最基本的協(xié)同刺激信號(hào)分子。適當(dāng)?shù)腂7/CD28信號(hào)對(duì)于在正常生理狀態(tài)下維持機(jī)體免疫應(yīng)答的適度性、有效性和特異性具有重要作用[5，6]。目前，很多研究發(fā)現(xiàn)，某些惡性腫瘤細(xì)胞如B淋巴瘤細(xì)胞表面存在異常的B7-CD28信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且該信號(hào)通路已被證實(shí)與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-9]。

本研究在自行制備腹水型CD86 mAb的基礎(chǔ)上，采用Protein A親和層析法純化抗體。以天然表達(dá)CD86分子的人B系淋巴瘤細(xì)胞Raji、Daudi和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞8266為觀察對(duì)象，將其與不同濃度的鼠抗人CD86 mAb共同孵育，分析抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑、儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、 胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Hyclone公司； PE標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、Coat Anti mouse IgG(H+L)HRP購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；FITC anti-human CD86 mAb、TranswellTM小室、APC AnnexinⅤ Apoptosis Detection Kit with PI均購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；降植烷(Pristane)購(gòu)自美國(guó)的Sigma公司；正置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；流式細(xì)胞儀(Cytoflex)購(gòu)自Beckman-Coulter公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Biorad公司。

1.1.2細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 能穩(wěn)定分泌鼠抗人CD86 mAb的雜交瘤細(xì)胞6E8、穩(wěn)定表達(dá)CD86分子的轉(zhuǎn)基因L929-CD86細(xì)胞、L929-mock細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；Raji細(xì)胞、Daudi細(xì)胞、8266細(xì)胞、HCT116細(xì)胞、A375細(xì)胞和7721細(xì)胞均購(gòu)自ATCC，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系本課題組保存并常規(guī)傳代培養(yǎng)；3～5周齡健康雌性裸鼠(nude)購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在蘇州大學(xué)動(dòng)物管理中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2方法

1.2.1雜交瘤細(xì)胞6E8的復(fù)蘇和CD86 mAb的制備與純化 取本實(shí)驗(yàn)室保存在液氮罐中的雜交瘤細(xì)胞6E8，在37℃溫水中進(jìn)行快速解凍，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將復(fù)蘇的細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增。收集生長(zhǎng)旺盛的雜交瘤細(xì)胞，注入經(jīng)Pristane致敏的裸鼠腹腔中，1×107個(gè)/只。輕輕按摩裸鼠腹部，使雜交瘤細(xì)胞充分分散在裸鼠腹腔。當(dāng)腹部隆起時(shí)，進(jìn)行腹水的抽取。經(jīng)3 000 r/min 離心10 min，收取上清。采用Protein A親和層析法對(duì)抗體進(jìn)行純化。過(guò)濾除菌后，分裝并保存在-80℃冰箱中。

1.2.2腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的培養(yǎng)與傳代 L929-mock、L929-CD86、Raji、Daudi、8266、HCT116、A375和7721細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。其中L929-CD86細(xì)胞、L929-mock細(xì)胞、HCT1-16細(xì)胞、A375細(xì)胞和7721細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，傳代時(shí)用5%的胰酶進(jìn)行消化。L929-CD86轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株為確保目的分子的穩(wěn)定表達(dá)，需用抗性篩選藥物Zeocin(500 μg/ml)進(jìn)行定期加壓培養(yǎng)。其余細(xì)胞均為懸浮生長(zhǎng)。間隔2～3 d進(jìn)行傳代即可。

1.2.3抗體對(duì)不同細(xì)胞表面CD86分子的識(shí)別 收集生長(zhǎng)旺盛的L929-mock、L929-CD86、Raji、Daudi、8266、HCT116、A375和7721細(xì)胞于流式分析管中，5×105個(gè)/管。分別加入CD86 mAb，100 μl(0.1 μg)/管。同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照組。4℃條件下孵育30 min，用含1%FBS的PBS洗2遍，再加入羊抗小鼠PE二抗，100 μl/管。4℃避光條件下孵育 30 min。用含1%FBS的PBS再洗2遍，加入PBS，500 μl /管。混合均勻后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD86分子的表達(dá)，所有數(shù)據(jù)經(jīng)FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.2.4CD86 mAb對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用 收集天然表達(dá)CD86分子的Raji、Daudi和8266細(xì)胞，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，3×104個(gè)/孔。分別加入終濃度為5、10、20 μg/ml的CD86 mAb。同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照組。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，先在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，將細(xì)胞用PBS洗2遍后轉(zhuǎn)移到流式分析管中，再加入3 μl APC標(biāo)記的AnnexinⅤ和6 μl PE標(biāo)記的PI。25℃、避光條件下孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，所有數(shù)據(jù)經(jīng)FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.2.5CD86 mAb對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 選擇生長(zhǎng)良好的Raji、Daudi和8266細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，6×103個(gè)/孔。加入終濃度分別為5、10、20、40 μg/ml的CD86 mAb。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h時(shí)，直接加入5 mg/ml MTT，10 μl/孔。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心去除上清，添加DMSO，150 μl/孔，終止反應(yīng)。避光條件下在搖床上輕搖15 min。用酶標(biāo)儀在參考波長(zhǎng)為630 nm的條件下，測(cè)定570 nm的OD值。并計(jì)算出抗體對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.6CD86 mAb對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響 收集生長(zhǎng)旺盛的Raji、Daudi和8266細(xì)胞，首先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)12 h。然后選用8 μm孔徑的24孔TranswellTM板，下室添加10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，650 μl/孔。上室接種細(xì)胞，3×104個(gè)/孔，并添加終濃度為20 μg/ml的鼠抗人CD86 mAb。同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)48 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，分別收集上室與下室中的細(xì)胞經(jīng)FCM進(jìn)行計(jì)數(shù)。并計(jì)算細(xì)胞的遷移率，遷移率=下室細(xì)胞總數(shù)/(上室細(xì)胞總數(shù)+下室細(xì)胞總數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1CD86 mAb的制備及純化 采用小鼠腹水誘生法制備單克隆抗體，裸鼠腹水形成率為100%(圖1)。收集的腹水產(chǎn)量平均為2.4 ml/只。經(jīng)Protein A親和層析法對(duì)抗體進(jìn)行純化，腹水中抗體蛋白的得率為1.6 mg/ml。

2.2抗體對(duì)細(xì)胞膜型CD86分子的識(shí)別 FCM分析結(jié)果顯示，鼠抗人CD86 mAb與L929-mock、L929-CD86、Raji、Daudi、8266、HCT116、A375和7721細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率分別為0.51%、100%、96.5%、99.0%、83.9%、2.87%、1.37%及1.00%(圖2)。該結(jié)果提示本研究制備的抗體對(duì)細(xì)胞膜型分子具有良好的識(shí)別能力。

圖1 小鼠腹水誘生法制備單克隆抗體Fig.1 Ascites induced by mouse to prepare monoclonal antibodies

2.3CD86 mAb影響腫瘤細(xì)胞的正常生長(zhǎng)并促進(jìn)其發(fā)生凋亡 抗體與Raji、Daudi、8266細(xì)胞共培養(yǎng)24 h時(shí)，顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞抱團(tuán)情況比較嚴(yán)重，這可能是由于抗體結(jié)合細(xì)胞表面的CD86分子所形成的交聯(lián)作用。細(xì)胞質(zhì)中有黑色顆粒物質(zhì)沉積，細(xì)胞的折光性和立體感減弱(圖3)。FCM結(jié)果顯示，抗體濃度為20 μg/ml時(shí)，上述細(xì)胞的凋亡率分別為16%、18%及14%(圖4)，均高于同型對(duì)照組，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4CD86 mAb對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT結(jié)果表明，共同孵育48 h，CD86 mAb終濃度在20 μg/ml 時(shí)對(duì)Raji、 Daudi和8266細(xì)胞的增殖已可產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)抗體濃度增至40 μg/ml時(shí)，細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(P<0.05)，其增殖抑制率分別為23%、25%、26%(圖5)。

圖2 不同細(xì)胞表面CD86分子的表達(dá)Fig.2 Expression of CD86 molecules on different cell surfaces

圖3 CD86 mAb對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(×200，標(biāo)尺=100 μm)Fig.3 Inhibitory effect of CD86 mAb on growth of cells(×200,bar=100 μm)Note: A.Raji-isotype control group;B.Raji-20 μg/ml CD86 mAb group;C.Daudi-isotype control group;D.Daudi-20 μg/ml CD86 mAb group;E.8266-isotype control group;F.8266-20 μg/ml CD86 mAb group.

圖4 CD86 mAb對(duì)Raji、Daudi和8266細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用Fig.4 Induced apoptosis of Raji，Daudi and 8266 cells by CD86 mAbNote: The final concentration of antibody is 20 μg/ml.

圖5 CD86 mAb對(duì)Raji、Daudi和8266細(xì)胞體外增殖的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of CD86 mAb on proliferation of Raji,Daudi and 8266 cells in vitroNote: *.P<0.05,compared with 0 μg/ml group.

圖6 CD86 mAb對(duì)腫瘤細(xì)胞體外遷移的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of CD86 mAb on tumor cell migration in vitroNote: *.P<0.05 compared with IgG group.The final concentration of CD86 mAb and IgG is 20 μg/ml.

2.5CD86 mAb對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的抑制作用 TranswellTM結(jié)果表明，終濃度為20 μg/ml的CD86 mAb與Raji、Daudi和8266細(xì)胞共同孵育48 h時(shí)，細(xì)胞的遷移率分別為26%、23%和24%。與同型對(duì)照組細(xì)胞的遷移率36%、33%和34%相比，實(shí)驗(yàn)組均低于同型對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示CD86 mAb對(duì)Raji、Daudi和8266細(xì)胞的遷移具有抑制作用(圖6)。

3 討論

本研究在自行建立的能穩(wěn)定分泌鼠抗人CD86 mAb的雜交瘤細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，經(jīng)小鼠誘生腹水法制備抗體，采用Protein A親和層析法對(duì)抗體進(jìn)行純化。通過(guò)免疫熒光法分析了該抗體對(duì)細(xì)胞膜型分子的識(shí)別與結(jié)合能力，結(jié)果顯示，該抗體與人B系淋巴瘤Raji、Daudi和多發(fā)性骨髓瘤8266細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率依次為96.5%、99.0%和83.9%，提示該抗體對(duì)抗原分子具有良好的識(shí)別能力。

為探討CD86分子在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的意義，及特異性抗體結(jié)合相應(yīng)膜型分子后對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及遷移的影響。本實(shí)驗(yàn)在獲取CD86 mAb的基礎(chǔ)上，以高表達(dá)CD86分子的Raji、Daudi和8266細(xì)胞為觀察對(duì)象，進(jìn)行了序貫研究。首先，研究腫瘤細(xì)胞表面的CD86分子是否與腫瘤的增殖有關(guān)。向上述細(xì)胞的培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度的CD86 mAb，共同培養(yǎng)48 h時(shí)。MTT結(jié)果表明，該抗體對(duì)細(xì)胞的增殖具有抑制作用且為抗體濃度依賴性。與同型對(duì)照組相比，終濃度為20 μg/ml的抗體對(duì)細(xì)胞增殖已可產(chǎn)生抑制作用(P<0.05)，當(dāng)抗體濃度增至40 μg/ml時(shí)，抑制效果更明顯，三種細(xì)胞的增殖抑制率均達(dá)到20%以上。相比于Daudi細(xì)胞，抗體對(duì)Raji細(xì)胞增殖的抑制效果較弱，但與8266細(xì)胞無(wú)明顯差別。該研究結(jié)果提示，上述腫瘤細(xì)胞表面的CD86分子可能直接或間接介導(dǎo)了細(xì)胞增殖與生長(zhǎng)的信號(hào)，當(dāng)該分子被特異性抗體封閉時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制。同時(shí)由于抗原抗體結(jié)合產(chǎn)生空間位阻影響了腫瘤細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，因此也會(huì)對(duì)其增殖起到抑制作用。

在CD86 mAb能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了特異性抗體通過(guò)封閉膜型分子后對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡是否有影響。將上述細(xì)胞分別與不同濃度的抗體進(jìn)行孵育。24 h時(shí)，采用FCM進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與同型對(duì)照組相比，終濃度為20 μg/ml的抗體可以顯著地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05)，Raji、Daudi和8266細(xì)胞的凋亡率均達(dá)到14%以上，其中抗體對(duì)Daudi細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用最為明顯，Raji與8266細(xì)胞相比無(wú)明顯差別。同時(shí)顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)抗體組細(xì)胞聚集嚴(yán)重，一方面可能是由于該抗體結(jié)合細(xì)胞表面的CD86分子所形成的交聯(lián)作用所致，另一方面可能為該抗體能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞在黏附分子的作用下相互黏連，形成體積較大的凝塊。細(xì)胞質(zhì)中有黑色顆粒物質(zhì)沉積，細(xì)胞的折光性和立體感減弱。在該分子被抗體封閉后能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了該抗體對(duì)細(xì)胞表面Fas及FasL的誘導(dǎo)作用，但與同型對(duì)照組相比，F(xiàn)as及FasL的表達(dá)并未發(fā)生明顯變化。提示該抗體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡并不是通過(guò)Fas-FasL途徑，可能是通過(guò)穿孔素-顆粒酶途徑或TNF-TNFR途徑發(fā)生凋亡。上述猜測(cè)需后續(xù)進(jìn)行更深入的研究探討。

接下來(lái)本研究繼續(xù)探討了腫瘤細(xì)胞表達(dá)的CD86分子是否與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。將不同濃度的抗體與Raji、Daudi和8266細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h。采用TranswellTM法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)終濃度為20 μg/ml的抗體對(duì)上述細(xì)胞的遷移具有抑制作用，細(xì)胞的遷移率依次為26%、23%和24%，與同型對(duì)照組36%、33%和34%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但抗體對(duì)Raji、Daudi和8266細(xì)胞遷移的抑制效果并無(wú)明顯差別。有研究報(bào)道，CD86分子在一些腫瘤的原代細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，而其在發(fā)生轉(zhuǎn)移或惡化程度高的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明CD86分子的異常變化與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其參與了腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鼠抗人CD86 mAb封閉該分子，能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移。腫瘤細(xì)胞遷移的物質(zhì)基礎(chǔ)為微絲、微管及中間絲組成的細(xì)胞骨架，而肌動(dòng)蛋白與微管蛋白又是組成微絲和微管的物質(zhì)基礎(chǔ)[10，11]。接下來(lái)，本研究將會(huì)進(jìn)一步探討抗體封閉細(xì)胞表面相應(yīng)抗原分子后，是否會(huì)通過(guò)影響肌動(dòng)蛋白或微管蛋白的合成，從而影響腫瘤細(xì)胞的遷移。

綜上所述，腫瘤細(xì)胞表面的CD86分子可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程?？贵w可作為特異性阻斷劑，通過(guò)封閉腫瘤細(xì)胞表面的CD86分子，抑制其增殖與遷移，促進(jìn)其發(fā)生凋亡，具有潛在的抗瘤效應(yīng)。