曹蘭秀 呂 娟 趙 嫻 王 江 馬 莉

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑教研室，咸陽712046)

朱砂七廣泛分布于秦嶺太白山，其多生長于草灘、山坡等環(huán)境[1]。研究發(fā)現(xiàn)其對白色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌等均可產(chǎn)生抗菌作用，具有廣譜抗菌的特性。與傳統(tǒng)的抗生素抗菌藥物的作用方式不同，中藥抗菌藥物具有多途徑、多靶點、多組分的特點，可同時由多種成分參與，多個作用靶點的相互關(guān)聯(lián)，在應(yīng)對細菌耐藥性方面具有自身的優(yōu)勢[2]。針對目前我國細菌耐藥性的嚴(yán)峻形勢，開展有特點、療效確切、不易產(chǎn)生耐藥性的中藥抗菌藥物研究對緩解細菌耐藥性問題具有積極的意義。

模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRR)在細菌感染和固有免疫產(chǎn)生過程中起到關(guān)鍵作用，其中以Toll樣受體(Toll like receptors,TLR)和NOD樣受體(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLR)分別作為胞外和胞內(nèi)模式識別受體得到了廣泛關(guān)注[3]。TNF-α、IL-6作為TLRs/NLRs下游的炎性因子，在機體受到細菌感染后發(fā)生炎癥反應(yīng)及機體防御過程中起到重要作用，其中IL-6是活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的細胞因子，可通過活化B細胞前體產(chǎn)生抗體，進一步與集落刺激因子協(xié)同促進原始骨髓源細胞的發(fā)育和分化過程，參與機體免疫反應(yīng)過程[4]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，可以被神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、細胞應(yīng)激、激素、細胞黏附等多種不同的細胞外刺激激活[5]。參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)等多種重要的細胞生理病理過程。NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，在腫瘤發(fā)生、炎癥因子基因表達等方面有重要的調(diào)控作用[6]。

本文從朱砂七對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)感染小鼠的保護作用及其機制進行探討，考察TLRs和NODs受體及其下游炎癥因子TNF-α、IL-6的變化，再通過mRNA和蛋白水平檢測MAPK和NF-κB信號通路的變化，以明確朱砂七是否拮抗金黃色葡萄球菌耐藥性，及其拮抗作用是否與TLRs和NODs受體及MAPK和NF-κB通路相關(guān)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 朱砂七藥材(北京同仁堂有限責(zé)任公司)通過水提醇沉方式提取，濾膜過濾除菌，再將其分裝標(biāo)記后保存于-20℃冰箱。營養(yǎng)肉湯、MH肉湯均用于藥物敏感試驗檢測。固體培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯中添加2%瓊脂粉，纖黏連蛋白(Sigma)。羊血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司)，1640培養(yǎng)基(Thermo fisher)；cDNA反轉(zhuǎn)錄、PCR Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)； MX3005P Real time PCR儀[Agilent Technologies(Stratagene)公司]；Synthesis kit(Bio Basic,Canada)；DEPC水(北京康為試劑有限公司)；戊二醛結(jié)晶紫、慶大霉素、Trizol、瓊脂糖、溴化乙錠均購自Thermo fisher。TLR2、NOD2、MAPK、NF-κB抗體購自Abcam。蛋白提取及定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物有限公司。

1.2方法

1.2.1耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的鑒定和培養(yǎng) 實驗用菌株(MRSA)為臨床致病菌，將其命名09-44，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理毒理研究室惠贈，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗驗證為青霉素抗性菌株。培養(yǎng)過程為：制備甘露醇高鹽瓊脂平板，接種細菌，挑取產(chǎn)生金黃色色素的單菌落，劃線營養(yǎng)瓊脂斜面。在試驗前一晚，挑取一環(huán)菌接種于營養(yǎng)肉湯中，并放置于37℃恒溫200 g搖床培養(yǎng)過夜(16 h)，再轉(zhuǎn)接100 μl 培養(yǎng)物于新鮮培養(yǎng)基中同條件培養(yǎng)2 h，均生長同步且處于對數(shù)生長期。收集所得菌液，在6 000 g 離心5 min，棄上清，用PBS洗滌1次，再將其重懸于1640維持液中，稀釋至所需濃度后待用。

1.2.2小鼠感染菌液的制備 挑取金葡菌一環(huán)菌，接入20 ml營養(yǎng)肉湯中，在37℃恒溫搖床200 g培養(yǎng)過夜(16 h)。次日收集1 ml菌液，在6 000 g離心5 min，棄上清后用無菌PBS洗滌1次，并重懸于1 ml PBS中，以PBS做稀釋液并10倍系列稀釋至10-7，取10-5、10-6、10-7共3個稀釋度涂布平板計數(shù)，計算實際感染量，同時取100、10-1、10-2菌液作為感染菌液(大、中、小劑量)。

1.2.3小鼠金葡菌肺炎模型建立及朱砂七的治療作用評價 40只雄性C57BL/6J，18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2016-006。適應(yīng)1周后，隨機分為4組，正常對照組，MRSA組，朱砂七組，青霉素組(陽性藥)。75%酒精消毒待感染小鼠肺部，用一次性無菌注射器吸取適量感染菌液，自小鼠右下側(cè)肋骨插人后注射，每只鼠注射體積為50 μl；其中正常對照組小鼠同法操作，注射等量PBS溶液，青霉素組在感染金黃色葡萄球菌后，立即自尾靜脈注射陽性藥青霉素溶液(Sigma，以PBS溶解，1×107U/kg)。朱砂七組感染金葡菌后，立即口服給藥朱砂七提取液(藥物濃度4 mg提取物/ml，給藥體積0.2 ml/10 g)。感染后持續(xù)觀察12 h，并記錄小鼠死亡情況。30 min 內(nèi)出現(xiàn)的小鼠死亡一般為機械損傷所致，不計入最后統(tǒng)計數(shù)量。在感染MRSA后2、4、8、12 h血液測其活菌數(shù)量并通過ELISA檢測血中IL-6、TNF-α水平。連續(xù)觀察7 d，記錄發(fā)病鼠的精神狀態(tài)，外觀體征及動物死亡情況。如出現(xiàn)動物死亡，立即剖殺，并小心取左肺部以10%多聚甲醛固定，取約5 mm × 5 mm ×4 mm大小的肺組織制作石蠟切片，用于組織HE染色，并觀察各組動物組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織壞死程度、發(fā)生組織浸潤、炎性反應(yīng)等。其余組織檢測相關(guān)基因表達水平。

1.2.4Real time PCR 各組動物取肺組織后，立即放入液氮中，轉(zhuǎn)入-80℃保存待用。RNA總提取過程：每100 mg肺組織中加1 ml Trizol，組織勻漿后，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，12 000 g，離心10 min。分別加200 μl氯仿至離心管中，冰浴放置10 min，渦旋，12 000 g，離心10 min，吸取上層后，轉(zhuǎn)移至另一離心管，0.5 ml異丙醇，室溫10 min，12 000 g，離心15 min，棄去上清后，加入1 ml 75%乙醇洗滌，3 000 g，離心5 min后棄上清。放置約15 min晾干，用100 μl DEPC水復(fù)溶，并檢測RNA純度(需A260/A280介于1.8～2.0之間)。逆轉(zhuǎn)錄采用MMLV第一鏈DNA合成試劑盒(Bio Basic Inc,CA)。各引物序列及相關(guān)信息如表1所示。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的Real time PCR反應(yīng)液中，進行Real time PCR擴增和檢測，與U6為內(nèi)參，2-ΔΔCT計算表達量。

1.2.5Western blot 組織總蛋白提取過程：每20 mg 肺組織中加0.5 ml RIPA裂解液，組織勻漿后，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，12 000 g，離心10 min。BCA法定量蛋白，用PBS將蛋白濃度調(diào)整一直后，按照80 μl樣品(較高濃度組用PBS調(diào)節(jié))加20 μl loading buffer，90℃ 10 min,4℃ 7 min蛋白變性。-20℃保存待用。

電泳采用預(yù)制膠(按照康為世紀(jì)提供配制方法，10%濃度分離膠)，電泳70 V，30 min后改為120 V 至電泳結(jié)束，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，TBST洗3次每次5 min，用5%脫脂牛奶封閉3 h，TBST洗3次每次5 min，一抗(1∶1 000)孵育4℃過夜，TBST洗3次，每次10 min，二抗(1∶3 000)常溫孵育1 h，TBST洗3次每次5 min，顯影。

2 結(jié)果

2.1朱砂七對MRSA感染小鼠死亡情況及組織病理變化的影響 通過對實驗小鼠狀況及死亡數(shù)統(tǒng)計(表2)，可以看出與MRSA組相比，朱砂七和陽性藥物青霉素均可以減少實驗動物的死亡數(shù)，改善存活動物的精神狀態(tài)。且朱砂七組動物的死亡只數(shù)略低于青霉素組，顯示了很好的治療效果。

表1PCR引物序列的名稱和溶解溫度

Tab.1NameanddissolutiontemperatureofPCRprimersequence

NameSerial number Primer sequenceTm(℃)TLR2NM-0119055′-TTTCACCACTGCCCGTAGAT-3′57.95′-TTCGCAGGAGCAAACAAAGT-3′MAPKNM-0108515′-CACTCGCAGTTTGTTGGATG-3′52.75′-TACTGTAGCAAAGGCACCC-3′IL-6NM-0082375′-CCGTGTGGTGTTAACCTTTG-3′60.55′-CATATCAGCAAGGGGTAGTC-3′TNF-αNM-0271135′-TTAGATCTGCCCGTAGAT-3′59.95′-AGTTCGCCAAAGGACAAAGT-3′NOD2NM-1458575′-CCGTGTGGTGTTAACCTTTG-3′55.85′-AGGATCAGCAGGTACATGTC-3′NF-κBNM-0093175′-AGCGAGACCTGGAGCAAG-3′55.65′-GGACCGCATTCAAGTCATAG-3′GADPHNM-0080855′-CCATGCCATCACTGCCACTCAGAAGAC-3′66.55′-GAGCGGCTCTCTCTTGCTCTCAGTATC-3′

通過HE染色可見，給藥后第4天MRSA組小鼠肺組織周圍有嗜酸性粒細胞，淋巴細胞等多種炎癥細胞的浸潤和聚集，支氣管平滑肌痙攣，管腔狹窄，管壁增厚等病理改變。相對模型組，朱砂七組小鼠肺組織炎癥細胞的浸潤和聚集明顯改善，見圖1。

2.2朱砂七對MRSA感染小鼠體內(nèi)活細菌數(shù)及血中TNF-α、IL-6的影響 與NC組動物相比，模型組TNF-α、IL-6在12 h顯著升高(P<0.05)，而朱砂七組和青霉素組可以降低TNF-α、IL-6升高的水平，但仍顯著高于NC組(P<0.05)。在檢測各時間點內(nèi)(2、4、8、12 h)，朱砂七組和青霉素組小鼠血液(0.1 ml,n=10)中的活菌數(shù)量均顯著低于MRSA組，動物體內(nèi)殺菌作用明顯。但在12 h內(nèi)，動物體內(nèi)活菌數(shù)量仍然較高。與使用青霉素陽性藥治療相比，朱砂七對動物體內(nèi)的MRSA殺傷作用更明顯，各時間點的活菌數(shù)量和TNF-α、IL-6更少(P<0.05)，見表3。

2.3朱砂七對MRSA感染小鼠肺TLR2、NOD2、TNF-α、IL-6、MAPK、NF-κB的mRNA表達水平的影響 通過Real time PCR方法考察朱砂七對MRSA感染小鼠肺組織內(nèi)TLR2、NOD2、TNF-α、IL-6、MAPK、NF-κB等mRNA表達水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NC組比較，MRSA組TLR2、NOD2及其下游炎性因子IL-6、TNF-α均有明顯上升(P<0.05)，陽性藥組、朱砂七組可顯著降低該上升趨勢，其轉(zhuǎn)錄水平的變化較為明顯(P<0.05)。MAPK、NF-κB信號通路的改變在MRSA模型組動物中也較為明顯，朱砂七可降低MRSA暴露動物的MAPK,NF-κB在mRNA的表達水平(P<0.05)。見圖2。

表2朱砂七對MRSA感染小鼠死亡情況的影響

Tab.2EffectofPolygonumCillinerveonsurvivalofmicewhichwereexposedtoMRSA

TreatmentNumber of survivals at different time(h)01234567NS1010101010101010MRSA105533111PC+MRSA108764444PG+MRSA107532222

2.4朱砂七對MRSA感染小鼠肺TLR2、NOD2、MAPK、NF-κB蛋白表達水平的影響 通過Western blot方法考察朱砂七對MRSA感染小鼠肺組織內(nèi)TLR2、NOD2、MAPK、NF-κB等蛋白表達水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NC組比較，MRSA組TLR2、NOD2均有明顯上升(P<0.05)，陽性藥組、朱砂七組可顯著降低該上升趨勢，其翻譯水平的變化與轉(zhuǎn)錄水平一致，也較為明顯。MAPK、NF-κB的蛋白表達水平也發(fā)生變化，在MRSA模型組動物也較為明顯(P<0.05)，朱砂七可降低MRSA暴露動物的MAPK、NF-κB在蛋白的表達水平(P<0.05)。見圖3。

圖1 各組動物肺組織HE染色結(jié)果(第4天，×200)Fig.1 HE staining results of lung tissue of mice in each group(4th day，×200)

表3朱砂七對感染小鼠血中TNF-α,IL-6及活菌數(shù)量的影響

Tab.3EffectofPolygonumCillinerveonTNF-α,IL-6andnumberofMRSAinmice

TreatmentIL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)Number of MRSA of different time(h)24812NC38.5±12.525.4 ± 26.60000MRSA998.4±136.52)1 099.6±112.72)6 123.2±212.42)3 210.9±277.12)2 188.7±210.42)1 129.5±238.62)PC+MRSA371.5±106.31)2)3)344.2±101.21)2)3)3 211.5±120.61)2)3)1 222.7±211.81)2)3)822.5±176.41)2)3)554.7±105.31)2)3)PG+MRSA439.0±93.61)2)544.1±99.71)2)3 877.9±190.41)2)2 886.7±182.51)2)1 996.4±221.51)2)889.3±112.31)2)

Note：Compared with MRSA,1)P<0.05;compared with NC,2)P<0.05;compared with PG+MRSA,3)P<0.05.

圖2 朱砂七對感染小鼠肺TLR2、NOD2、TNF-α、IL-6、MAPK、NF-κB的mRNA表達水平的影響(n=10)Fig.2 Effect of Polygonum Cillinerve on mRNA expression of TLR2,NOD2,TNF-α,IL-6,MAPK and NF-κB of mice exposed to MRSA(n=10)Note: Compared with MRSA,*.P<0.05;compared with NC,#.P<0.05;compared with PG+MRSA,&.P<0.05.

圖3 朱砂七對感染小鼠肺TLR2、NOD2、MAPK、NF-κB的蛋白和表達水平的影響(n=10)Fig.3 Effect of Polygonum Cillinerve on protein express-ion of TLR2,NOD2,MAPK and NF-κB of mice exposed to MRSA(n=10)Note: Compared with MRSA,*.P<0.05;compared with NC,#.P<0.05;compared with PG+MRSA,&.P<0.05.

3 討論

本文從朱砂七對MRSA感染小鼠的保護作用及其機制進行探討，考察TLRs和NODs受體及其下游炎癥因子TNF-α、IL-6的變化，再通過檢測MAPK和NF-κB轉(zhuǎn)錄水平的變化，以明確朱砂七是否拮抗金黃色葡萄球菌耐藥性，及其拮抗作用是否與TLRs和NODs受體及MAPK和NF-κB通路相關(guān)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，朱砂七可顯著降低MRSA小鼠的死亡率；在對血液中的活菌數(shù)量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檢測的各時間點內(nèi)(2、4、8、12 h)，朱砂七治療組小鼠血液中的活菌數(shù)量均顯著低于MRSA模型組。動物體內(nèi)殺菌作用明顯。且朱砂七可以降低MRSA引起的TNF-α、IL-6水平的升高。在mRNA水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)MRSA模型組TLR2、NOD2及其下游炎性因子IL-6、TNF-α均有顯示上升，朱砂七組可顯著降低該上升趨勢，在蛋白水平也得到相似的結(jié)果。另外朱砂七可降低MRSA暴露動物的MAPK、NF-κB信號通路在mRNA和蛋白的表達水平。說明其發(fā)揮拮抗MRSA產(chǎn)生的炎癥變化很可能與MAPK、NF-κB信號通路相關(guān)。

TLRs/NODs模式識別受體在細菌感染和機體固有免疫過程中起到關(guān)鍵作用[7]。其下游的炎性因子TNF-α、IL-6在細菌感染宿主后發(fā)生的炎癥反應(yīng)過程，其中IL-6是一類由活化T細胞及成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子，參與機體免疫反應(yīng)過程[8]。多項研究表明IL-6作為重要的調(diào)控因子參與炎癥反應(yīng)的多個環(huán)節(jié)，起關(guān)鍵作用。MAPK、NF-κB信號通路是生物體內(nèi)重要的分子通路，參與細胞正常生長、分化、腫瘤、炎癥等，朱砂七具有抗炎，抗氧化等多種生物學(xué)作用，臨床應(yīng)用療效顯著[9-12]。與傳統(tǒng)抗生素抗菌藥物的作用方式相比，具有多途徑，多靶點，多組分的優(yōu)勢。針對抗生素耐藥性問題，開發(fā)有價值的中藥抗菌藥物復(fù)方或單體，有助于更好地為微生物感染及相關(guān)疾病的防治提供新思路。

NF-κB活化可促進間質(zhì)巨噬細胞的間質(zhì)浸潤，導(dǎo)致肺組織萎縮和纖維化[13]。炎性因子TNF-α是炎癥的早期階段的重要介質(zhì)參與肺組織的炎癥形成。TNF-α作為多種細胞因子的調(diào)控中心，參與IL-1、IL-6等多種炎癥細胞因子的釋放，最終促發(fā)炎性因子的級聯(lián)反應(yīng)，在組織炎癥形成過程中，TNF-α受體相關(guān)因子及下游因子能直接與NF-κB受體信號分子結(jié)合形成核因子，進而激活NF-κB在Toll樣受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14]。TNF-α是NF-κB的活化和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要樞紐，參與NF-κB活化，其可激活下游的IL-6 mRNA表達水平，從而提高人體液中IL-6的水平。另外，TNF-α又可快速誘導(dǎo)p38MAPK的磷酸化在多種疾病發(fā)展過程中起到重要作用[15]。而NF-κB可反向調(diào)控TNF-α等炎性介質(zhì)的形成和修飾過程中多種關(guān)鍵酶的形成過程。本研究表明，小鼠動物死亡率與血清TNF-α、IL-6，小鼠肺組織TLR2、NOD2正相關(guān)，且與MAPK、NF-κB通路正相關(guān)，因TNF-α、IL-6、MAPK與NF-κB四者之間在炎癥進程中具有一定的相關(guān)性，進而推測朱砂七可能通過調(diào)控動物體內(nèi)的MAPK、NF-κB信號通路，參與調(diào)控TLRs/NODs模式識別受體的表達，影響機體固有免疫過程，降低MRSA感染后炎性因子TNF-α、IL-6的表達，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。