張熠霖 皇曉燕 趙瀅瀅 舒興盛 王子梅 應穎

摘要：胰島素的生理作用及分泌調(diào)節(jié)是《內(nèi)分泌系統(tǒng)》的重點內(nèi)容，學生通過實驗課的實踐操作有助于加深對理論知識的了解。本文介紹了我院傳統(tǒng)《內(nèi)分泌系統(tǒng)》胰島相關實驗課程設置的缺點，及針對此進行的整合實驗改革的內(nèi)容及成果，并就存在的難點問題做了分析與探討。

關鍵詞：內(nèi)分泌系統(tǒng);糖尿病;胰腺;β細胞;胰島素

中圖分類號：G640;R587.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：B? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.006

文章編號：1006-1959（2019）01-0018-03

Experience in the Integration Experiment of Diabetic Islet Lesions and Islet β-cell Insulin Secretion Damage Detection

ZHANG Yi-lin，HUANG Xiao-yan，ZHAO Ying-ying，SHU Xing-sheng，WANG Zi-mei，YING Ying

（Health Science Center School of Basic Medical Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060， Guangdong，China）

Abstract：The physiological function and secretion regulation of insulin are the key contents of endocrine system. The practical operation through experimental courses will be benefit to deepen the understanding of theoretical knowledge. This article introduces the shortcomings of the traditional islet related experiments of endocrine system in our school， as well as the contents and achievements of the integrated experimental reform carried out in this regard. We also discuss and analyze the difficult problems of existence.

Key words：endocrine system， diabetes， pancreas， β cells， insulin

《內(nèi)分泌系統(tǒng)》是一門與臨床醫(yī)學息息相關的重要基礎課程。而胰腺相關疾病里，糖尿病是一種由諸如環(huán)境因素、遺傳因素、應激因素等多重因素引起的慢性非傳染的代謝性疾病[1]。其發(fā)病機制是由于胰島β細胞受損而引起胰島素分泌減少、胰島素受體減少或敏感性降低的一類自身免疫性疾病，是全人類慢性病中的一個重大難題[2]。有研究表明，糖尿病與阿爾茨海默癥也具有一定的關聯(lián)性[3]。之前的實驗課程設置中，在內(nèi)分泌系統(tǒng)胰島相關的實驗教學方面，基于8學時的課程要求，學生只進行了正常小鼠胰島分離與胰島素分泌刺激兩部分實驗，實驗設置方面未涉及糖尿病胰島病變和胰島β細胞胰島素分泌受損的檢測，在胰島相關教學上顯得較為蒼白，極大地限制了學生對于內(nèi)分泌系統(tǒng)中胰腺常見疾病——糖尿病的全面了解。針對存在的問題，我們進行了整合實驗改革，在同樣有限的學時內(nèi)，加入糖尿病模型鼠的實驗組，并采用實驗動手教學與多媒體教學相結(jié)合，深化學生對胰島素正常生理作用及分泌異常導致糖尿病發(fā)生發(fā)展的發(fā)病機制的全面了解。在教學實踐過程中，讓學生通過：①了解糖尿病小鼠造模;②小鼠葡萄糖耐量實驗與小鼠胰島素耐量實驗驗證造模并分析;③分離小鼠胰島觀察葡萄糖糖刺激胰島素分泌情況;④胰腺組織切片染色觀察胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)或胰島素含量變化等一系列試驗來強化學生對糖尿病發(fā)生發(fā)展的認知，加強了理論與實踐的結(jié)合能力，促進了教學與科研的結(jié)合，也大大提升了教學效率，對學生日后的學習理解起到良好的促進，有利于今后的綜合發(fā)展。

1整合實驗改革內(nèi)容

1.1課前準備? 此項要求教師及實驗技術(shù)助理有較好的專業(yè)技能和長時間的準備。

1.1.1糖尿病造模? 糖尿病鼠造模常規(guī)為鏈脲佐菌素STZ造模和高脂飼養(yǎng)造模。因STZ鼠造模會損傷胰島β細胞[4]，大量降低后面胰島分離所得數(shù)量，我們采取高脂造模，采用4周齡的小鼠于清潔動物房高脂飼養(yǎng)12周。此部分由教師及實驗員實驗前期提前準備。

1.1.2饑餓處理與試劑準備? 在做胰島素耐量實驗IPITT和口服葡萄糖耐量實驗OGTT之前饑餓小鼠8 h，準備好注射要用的胰島素溶液與葡萄糖溶液。

1.1.3制作胰腺石蠟切片及免疫熒光染色，圖片儲存用于多媒體教學展示? 造模成功以后，殺鼠取胰腺在多聚甲醛中固定72 h，做脫水包埋。切5 μm薄片做免疫熒光染色。免疫熒光染色法標記insulin和DAPI，以檢測胰島素的分泌情況。將拍好的圖片制成PPT用于課堂多媒體教學的展示，使學生掌握正常及糖尿病小鼠胰島的鏡下結(jié)構(gòu)，胰島素含量及分泌的差異，觀察對理論知識的掌握。

1.1.4分離胰島[5]? 此部分由教師和學生分別完成。教師在實驗前1 d分離胰島并過夜培養(yǎng)，為學生第2天的葡萄糖刺激胰島素分泌實驗做好準備;學生在實驗當天練習胰島的原代分離，掌握胰島的分離方法及觀察胰島的光鏡下結(jié)構(gòu)。

1.2實驗操作過程

1.2.1第1～2學時? 胰島素調(diào)節(jié)血糖的生理作用及胰島素分泌調(diào)節(jié)檢測：①體重稱量：稱每只小鼠對應體重，按編號記錄;②IPITT[6]：分對照組和糖尿病DM組，按小鼠體重注射相應的胰島素量，測量兩組小鼠胰島素耐量，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制對應曲線圖，分析對比;③OGTT：分對照組和DM組，按小鼠體重注射對應葡萄糖量，測兩組小鼠的糖耐量，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制對應曲線圖，分析對比;④測空腹胰島素含量：用毛細管采眼球血100 μl，靜置20 min，5000 g離心15 min，取血液上清放-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2第3～5學時? 胰島分離及結(jié)構(gòu)觀察。顯微鏡鏡下觀察與多媒體教學相結(jié)合，觀察胰島結(jié)構(gòu)：①分離胰島：處死小鼠后給胰島點注射膠原酶P，消化后沉淀分離，體式顯微鏡下觀察兩組小鼠的胰島形態(tài)并作比較;②倒置熒光顯微鏡下觀察老師制備好的免疫熒光染色片子，讓學生找出胰島并觀察兩組胰島的區(qū)別;觀察對照與糖尿病組胰島素的分布和含量的變化;③多媒體播映前期教師拍攝的免疫熒光染色圖片，加深對糖尿病胰島病理改變的理解。

1.2.3第6～8學時? 葡萄糖刺激胰島素分泌檢測：挑取老師課前1 d準備的數(shù)量相同，大小差異不明顯的胰島放入24孔板中，做糖刺激胰島素分泌實驗。收上清與前期實驗收集的空腹血清，ELISA法檢測胰島素含量。

2整合實驗所取成效

2.1加強學生對糖尿病胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能改變的全面了解? 通過實驗整合后的學習，學生從以往單純片面地對正常小鼠胰島分泌情況有所了解，過渡到對正常小鼠與糖尿病小鼠的外觀形態(tài)、胰島素耐量、糖耐量、胰島形態(tài)變化、胰島素分泌情況等有了全面深刻的理解，并且因為有了正常與疾病小鼠的對比，使學生對生理條件下和糖尿病疾病條件下的胰島差異有了更加清晰明確的認知。

2.2實踐教學與多媒體教學結(jié)合，更加生動全面? 在8個學時有限的時間內(nèi)，通過教師充分的實驗課前準備，用多媒體展示免疫熒光染色，更加直觀生動地展示正常鼠與糖尿病鼠胰島素的分泌差異;并且漂亮的圖片也能吸引學生的注意力，提高課堂教學效率。這種多媒體展示與他們的動手實踐相結(jié)合，使其更為全面的了解兩種小鼠的胰島特征與差異。

2.3學生的實驗技術(shù)學習更全面? 本實驗課程不僅涉及到以往傳統(tǒng)的胰島分離和糖刺激胰島素分泌檢測，并且結(jié)合了IPITT、OGTT、眼球毛細管取血等技術(shù)，學習了解了免疫熒光染色的相關知識，讓學生在有限的時間內(nèi)多動手動腦，系統(tǒng)的掌握胰島的組織學及生理、病理學相關實驗，提高動手能力，為以后打下堅實的科研基礎。

2.4加深學生對課本理論知識的理解? 課本知識相對抽象與乏味，通過實驗前基礎知識的理解結(jié)合課程過程動手實踐相結(jié)合，使相關知識具體化、直觀化，促進學生對知識點的理解記憶，并能在以后的生涯中起到一定的指示作用。

3整合實驗的難點與存在問題

3.1對授課教師和實驗技術(shù)員要求較高? 因為課前準備實驗較多，需要授課教師與實驗技術(shù)人員花費較多時間準備，由于老鼠較多，在糖刺激分泌實驗前1 d 分離胰島需要花費大量的時間。尤其在老鼠造模階段更需要花費大量時間精力。并且教師與實驗技術(shù)員需要熟練掌握小鼠造模、小鼠毛細管眼球取血、小鼠胰腺組織的摘取固定與脫水包埋、胰島分離與胰島培養(yǎng)等技術(shù)，并需把握好饑餓處理時間，提前配制好胰島素溶液與葡萄糖溶液，保存血液上清等。這些課前準備的任務過重可能也需要更多的實驗專業(yè)技術(shù)人員的配備。

3.2小鼠需要數(shù)量較多? 整個實驗課程下來，不僅需要對照組老鼠，并且糖尿病鼠造模需要較多的老鼠，在做IPITT與OGTT以及眼球毛細管取血中可能會由于學生操作不當造成老鼠死亡，以至于老鼠的消耗量上升。

3.3老鼠的飼養(yǎng)周期延長? 因需要小鼠造模，所以購買回來的小鼠飼養(yǎng)周期大大延長，期間小鼠的飼養(yǎng)與管理難度加大，將占用大量空間，花費更多的人力、物力。

3.4時間相對緊迫? 實驗安排非常緊湊，多項實驗需同時進行，不僅對教師的全體把控提出要求，也對學生的時間控制，動手能力，以及課前實驗相關基礎知識的了解有一定要求，動手能力差，不會把控時間的學生可能會在課時內(nèi)完不成完整的實驗，需要教師，實驗技術(shù)員在課程中引導與幫助。也由于時間關系，實驗原理需要學生課前有預習，老師做適量講解以縮短課時時間的花費。

4總結(jié)

通過對內(nèi)分泌系統(tǒng)中與胰腺相關的組織胚胎學、生理學、病理學各實驗的有效整合，盡管增加了諸多復雜性，難度系數(shù)大大上升，但其能使此項實驗教學更加全面直觀生動，增強學生自主學習能力與全面動手能力，提高學生實驗學習效率，即提高了教學效率與教學效果。

參考文獻：

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[3]趙晶，婁培安，陳培培，等.2型糖尿病合并老年癡呆的患病現(xiàn)況及影響因素[J].中國老年學雜志，2015，35（10）：2796-2798.

[4]馮潤，蔣思旸，呂曉鋒，等.動物模型在糖尿病研究中的選擇與應用[C]//中國北方實驗動物科技年會，2017.

[5]顏迪恩，周迎生，高秀瑩，等.小鼠胰島分離純化方法研究[J].器官移植，2015，6（2）：111-115.

[6]Xu F，Liang FX，Chen R，et al.Eelectroacupuncture improves insulin sensitivity in high-fat-diet-infuced insulin resistance rats via activation of SIRT1 AND GLUT4 in quadriceps femoris[J].Journal of Integrative Medicine，2014（3）：231-232.