孫 晶, 譚 力, 曹 玲*, 王偉國, 馮有龍, 杭太俊

(1. 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院, 江蘇 南京 210019; 2. 中國藥科大學藥學院, 江蘇 南京 210008)

為滿足我國化妝品監(jiān)管實際的需要,結(jié)合行業(yè)發(fā)展和科學認識的提高,2015年國家食品藥品監(jiān)督管理總局組織完成了對《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版,簡稱《衛(wèi)生規(guī)范》)的修訂工作,編制了《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版,簡稱《技術規(guī)范》, 2016年12月1日施行)。該《技術規(guī)范》定義防腐劑為以抑制微生物在化妝品中的生長為目的而在化妝品中加入的物質(zhì)。一方面,防腐劑為化妝品中限用物質(zhì),過量或不適當使用會出現(xiàn)不良反應[1],如過量使用甲基異噻唑啉酮(MIT)會引起接觸性皮炎[2];對羥基苯甲酸類防腐劑隨著碳鏈長度的增加,雌激素屬性會隨之增加[2]。另一方面,國內(nèi)出現(xiàn)“無防腐劑添加”熱潮,實為不良媒體和商家夸大防腐劑的副作用,加入一些沒有列入防腐劑準用清單但具有防腐活性的物質(zhì)[2,3],誤導消費者。

必須明確化妝品確實需要具有防腐效能的物質(zhì)存在,但應加強監(jiān)管,《技術規(guī)范》在編排時通過與全球主要國家和地區(qū)化妝品相關法規(guī)標準進行比對分析,列出了允許使用的防腐劑準用組分清單,細化和調(diào)整了化妝品中防腐劑的禁限用組分要求[4],從原《衛(wèi)生規(guī)范》中收錄的56種準用防腐劑修訂減少至51種,刪除了氯乙酰胺、聚季銨鹽-15、烏洛托品等5種防腐劑[4];但是《技術規(guī)范》所列出的防腐劑測定方法卻不能滿足防腐劑監(jiān)管的需要,這在近幾年國家風險監(jiān)測防腐劑的測定中逐漸暴露。如實際測定的防腐劑種類與配方標簽不符,可能是因為配方添加量低于方法檢出限,或方法專屬性差,無法排除基質(zhì)干擾,易造成誤判[5]。《技術規(guī)范》中“ 防腐劑檢測方法”項下共收錄11種防腐劑的檢測方法(共能測定27種防腐劑)。但尚有許多配方中有使用和標注但《技術規(guī)范》未收載檢驗方法的情況。它們多為高效液相色譜法,個別為氣相色譜法,由于大多數(shù)防腐劑相對分子質(zhì)量小于200,且共軛體系簡單,紫外光譜特征不明顯,故HPLC-UV的專屬性和靈敏度均較差;僅有苯甲醇和苯甲酸相關方法項下收錄了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，用于GC和LC測定結(jié)果為陽性時的驗證方法。為加強監(jiān)管效力,填補監(jiān)管空白,有必要建立更廣泛、更專屬、更靈敏、高通量的防腐劑測定方法。目前文獻報道的化妝品中防腐劑的測定方法主要有氣相色譜法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7,8]、液相色譜法[9,10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11,12]和毛細管電泳法[13,14]等。

本文參考《技術規(guī)范》收載方法，即日常監(jiān)管覆蓋的防腐劑種類和準用防腐劑目錄,對市面上常用防腐劑進行調(diào)研選擇,并加入部分具有防腐效能的物質(zhì),建立了一種靈敏度高、專屬性良好的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測定方法,可以同時測定并確證25種常見防腐類物質(zhì)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 7890/7000B氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、0.22 μm有機相濾膜(美國Agilent公司); XP6百萬分之一分析天平、十萬分一天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司);萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司); KQ_300型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,超聲頻率:40 KHz;超聲功率:300 W); ST 16R高速離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司); Milli-Q高純水發(fā)生器(美國Millipore公司)。

甲醇為色譜純,由德國Merck公司提供;無水硫酸鈉、L(+)-抗壞血酸為分析純,均由國藥集團化學試劑有限公司提供。105批供試化妝品均為市售樣品。

25種防腐劑對照品的信息見表1,其中苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯、對羥基苯甲酸異丙酯、脫氫乙酸購自上海安譜實驗科技股份有限公司,1,3-二羥甲基-5,5-二甲基海因(DMDMH)購自山東西亞化學股份有限公司,2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚購自中國食品藥品檢定研究院,其余防腐劑均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;內(nèi)標物質(zhì)(IS):苯酚(批號31016,純度99.9%)、2-辛醇(批號94900,純度98.0%)和七氯(批號118148,純度99.0%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 標準溶液的配制

混合標準儲備液:取苯甲醇、苯氧乙醇、苯氧異丙醇對照品各約80 mg,甲基異噻唑啉酮、甲基氯異噻唑啉酮、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)對照品各約20 mg,其他對照品各約40 mg,置于同一100 mL棕色量瓶中,加入0.1 mg/mL L(+)-抗壞血酸甲醇溶液適量,溶解并稀釋至刻度,混勻。

表 1 25種防腐劑的試藥信息和使用限度Table 1 Compound information and operation limits of the 25 preservatives

1) calculated on the basis of its acid; 2) total content of benzoate≤0.5%; 3) total content of parabens≤0.8%; /: no provision in the regulation.

混合內(nèi)標溶液:取3種內(nèi)標物質(zhì)各約4 mg,置于10 mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,混勻。

1.3 樣品前處理

取混勻的化妝品試樣約0.2 g(帶有載體的面膜,去除載體后混勻),精密稱定,置于具塞離心管中,加入混合內(nèi)標溶液100 μL,再加入0.1 mg/mL L(+)-抗壞血酸甲醇溶液10 mL,渦旋30 s,再加入無水氯化鈉約0.50 g,超聲提取20 min,振搖混勻,以5 000 r/min離心5 min,上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,取續(xù)濾液作為待測溶液。

1.4 分析條件

HP-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度:250 ℃;分流比10∶1;載氣:He;載氣流速:1.0 mL/min。程序升溫:初始溫度為60 ℃,保持2 min,以30 ℃/min的速率升溫至120 ℃,保持4 min,再以20 ℃/min的速率升溫至160 ℃,保持8 min,最后再以45 ℃/min的速率升溫至280 ℃,保持3.5 min。進樣體積:1.0 μL。

電離源：EI源;離子源溫度：230 ℃;傳輸線溫度：250 ℃;電子能量：70 eV;溶劑延遲時間：4 min;選擇反應監(jiān)測模式(MRM)。其他參數(shù)見表2。

表 2 25種防腐劑的保留時間(RT)、離子對和豐度比Table 2 Retention times (RTs), ion pairs and abundance ratios of the 25 preservatives

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的優(yōu)化

2.1.1進樣口溫度的優(yōu)化

考察進樣口溫度分別為200、220、240、260和280 ℃時各目標化合物的響應情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),針對苯甲酸和脫氫乙酸,當進樣口溫度為200 ℃時,響應較低,當進樣口溫度升至240 ℃時,響應和峰形明顯升高和改善,繼續(xù)升溫,無明顯改善。其他物質(zhì)在此范圍內(nèi)受進樣口溫度影響不大。因此實驗最終選擇250 ℃。

2.1.2內(nèi)標物質(zhì)的選擇

內(nèi)標法測定可以顯著提高進樣精密度,在一定程度上消除樣品提取過程和質(zhì)譜基質(zhì)效應帶來的誤差。實驗初期，在10余種直鏈烷醇中選擇了出峰時間合適的正庚醇、正癸醇和正十六醇作為內(nèi)標物質(zhì),雖然實驗中測定的105批化妝品中均未檢出這些直鏈烷醇,但該類物質(zhì)可能存在于化妝品香精中,為防止干擾,最終根據(jù)保留時間和化妝品中存在的可能性,選擇2-辛醇、苯酚和七氯作為內(nèi)標物質(zhì),又根據(jù)回收率測定結(jié)果,選擇使回收率最接近100%的物質(zhì)作為對應目標化合物的內(nèi)標。苯酚作為苯甲醇、MIT、苯氧乙醇和MCIT的內(nèi)標;2-辛醇作為苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯氧異丙醇、DMDMH、脫氫乙酸、4-羥基苯甲酸甲酯、BHA和BHT的內(nèi)標;七氯作為其他物質(zhì)的內(nèi)標。

2.1.3其他檢測條件的優(yōu)化

對程序升溫條件進行了優(yōu)化,實現(xiàn)了25種防腐劑和3種內(nèi)標物質(zhì)的有效分離(見圖1)。另外,實驗還對各個化合物的分析時間段(segment)和駐留時間(dwell time)進行了優(yōu)化,以保證其良好的峰形和靈敏度。

2.2 提取條件的選擇和優(yōu)化

由表1可以看出,化妝品中防腐劑的允許加入量差異較大,對于安全性較低、響應較差的防腐劑，如甲基氯異噻唑啉酮,需要加大取樣量或進行樣品濃縮；對于限量較高的防腐劑，如苯氧乙醇和苯甲醇,需要進一步稀釋樣品。由于25種目標防腐劑極性相差較大,因此沒有進行固相萃取的嘗試。實驗初期嘗試了氮氣吹干和減壓離心濃縮的方式處理供試品,測定結(jié)果表明苯甲醇、苯氧乙醇、苯氧異丙醇等物質(zhì)的回收率顯著降低,可能與此類物質(zhì)揮發(fā)性高有關,故最終選擇了直接溶劑提取的方式。為了兼顧各防腐劑的溶解度和與高效液相色譜法(外標定量法)的兼容性,實驗最終選擇甲醇為提取溶劑;為了保護氣相色譜柱,加入無水硫酸鈉脫水步驟;為

圖 1 25種防腐劑和3種內(nèi)標的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the 25 preservatives and three internal standardsPeaks 1-25 and IS 1-3 were the same as that in Table 2.

了消除樣品和試劑不溶物對終濃度的影響,沒有采用定容的方式,而是采用精密加入10.00 mL的甲醇提取。

實驗發(fā)現(xiàn)，隨著超聲時間的延長,抗氧劑(BHA、BHT、TBHQ和BHQ)、IPBC和對羥基苯甲酸酯類的回收率均有一定程度的下降,推測與溫度上升,物質(zhì)加速氧化相關,故向甲醇中加入0.1 mg/mL的L(+)-抗壞血酸作為抗氧劑。根據(jù)總離子流色譜圖基線漂移情況,將溶劑延遲時間推遲至4 min。經(jīng)驗證,加入L(+)-抗壞血酸后樣品的回收率滿足測定要求。

2.3 方法學考察

2.3.1線性范圍、檢出限和定量限

在最優(yōu)測定條件和提取條件下,對該方法的線性范圍、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)進行驗證,結(jié)果見表3。參考限度范圍要求,配制系列濃度標準溶液,得到目標化合物的線性范圍、線性方程和相關系數(shù),由于防腐劑測定濃度跨度較大,為了準確定量,采用分段回歸的方法。采用樣品空白基質(zhì)溶液稀釋標準溶液,以3倍信噪比和10倍信噪比確定方法的檢出限和定量限。25種防腐劑在其各自的線性范圍內(nèi)線性關系良好,相關系數(shù)均大于0.995,方法的檢出限為0.08～0.99 μg/kg,定量限為0.27～3.30 μg/kg。

表 3 25種防腐劑的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)(r)、檢出限與定量限Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of the 25 preservatives

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

2.3.2方法回收率和進樣精密度

向水、乳液和膏霜3種性狀的空白樣品中添加4個不同水平的混合對照品溶液，進行方法回收率驗證,采用內(nèi)標法計算。苯甲醇、苯氧乙醇和苯氧異丙醇的添加濃度為0.040、0.16、1.0和4.0 mg/kg; MIT、MCIT和IPBC的添加濃度為0.010、0.040、0.25和1.0 mg/kg;其他對照品的添加濃度為0.020、0.080、0.50和2.0 mg/kg。結(jié)果表明,25種防腐劑的加標回收率為82.3%～119.4%, RSD≤14.3%(見表4)。

表 4 (續(xù))Table 4 (Continued)

2.4 實際樣品測定

對105批市售化妝品進行測定,包括20批嬰幼兒護膚類、15批美白類、20批防曬類、20批沐浴類、20批面膜和10批其他非特殊類化妝品,其中典型色譜圖見圖2。對所測樣品中防腐劑的使用種類、用量范圍和使用頻率(見表5)進行統(tǒng)計。結(jié)果表明,苯甲酸、氯苯甘醚、4-羥基苯甲酸異丁酯和MCIT存在超限添加的情況,約占總批數(shù)的6%;存在標簽標識與檢出結(jié)果不符的情況。防腐劑添加的種類、添加量與化妝品種類呈現(xiàn)一定的相關性:沐浴類化妝品主要使用苯甲酸類防腐劑;防曬類化妝品主要使用對羥基苯甲酸酯類防腐劑;嬰兒護膚類主要使用苯氧乙醇;MCIT主要在沐浴類化妝品檢出;面膜類化妝品中防腐劑含量較少。BHT在所有防曬類化妝品中均有檢出,但標簽標識的只有3批,該類抗氧劑容易光降解,存在安全風險[8], 《技術規(guī)范》并未指明其限度,后續(xù)應加強風險監(jiān)測和監(jiān)管。

圖 2 實際化妝品樣品中25種防腐劑的典型TIC圖Fig. 2 Typical total ion chromatograms of the 25 preservatives in cosmetics samplesPeaks 3, 5, 6, 11, 13, 14, 17, 20, 21, 23 and 25 were the same as that in Table 1.

Compound Contents/(μg/kg)Baby skin care (n=20)Bathing (n=20)Sunscreen (n=20)Facial mask (n=20)Whitening (n=15)Others (n=10)Detection rate/%Benzoic acid15357-626627-718-3184227-4831.4Methyl benzoate------0Ethyl benzoate-5-16371)-1-531)-141)20.0Phenyl benzoate------0Benzyl benzoate-2-851)27-441)-461)-7.6Benzoates1531)13-79041)27-711)1-3711)42-461)27-621)38.1Methylparaben190-10641)1-4471)338-13431)31-36131)30-14111)110-6981)53.3Ethylparaben4461)951)21-3971)191)4221)4161)12.4Isopropyl paraben------0Propylparaben25-4081)28-541)153-7771)28-741)24-4031)1451)30.5Isobutylparaben-461)401)---1.9Butylparaben3651)731)621)---2.9Parabens111-18751)1-6681)360-21221)19-36131)55-22361)110-11141)58.1Benzyl alcohol-14-7803-1152-72-7615.2Phenoxyethanol1142-420564-563762-575956-2819130-5603380-526154.3Phenoxyisopropanol-19-17-19--2.9MIT7-807-9544-9410-8358-758-8434.3MCIT-6-22---7-181.9Benzyl salicylate31-381)8-4131)25-401)-411)109-1931)16.2Dehydroacetic acid1959-----1.0IPBC2-178-757-21-6-10615.2Chlorphenesin15904775145-340932-223231128.6DMDMH3312---1983-1.9BHA51-2-10-5-384-7.6BHT1-2491-8247-327-1-301746.7TBHQ------0BHQ------0

1): calculated on the basis of its acid; -: not detected.

3 結(jié)論

本研究建立了GC-MS/MS同時測定化妝品中25種防腐類化合物的檢測方法,與《技術規(guī)范》收載方法相比,具有高專屬性、高靈敏度和高通量性的特點,可以同時完成定性和定量,適用于多種基質(zhì)、多種防腐劑同時使用的化妝品的測定,為化妝品中防腐劑的綜合監(jiān)控和管理提供了高效、可靠的技術支持。