劉哲涵, 張 鑫, 梁阿新, 孫立權(quán), 羅愛芹

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081)

三聚氰胺(melamine, MEL),是一種重要的三嗪類含氮雜環(huán)有機化工材料,廣泛應(yīng)用于塑料、木材加工、皮革制造、醫(yī)療、電氣等行業(yè)[1]。由于三聚氰胺具有高達(dá)66%的含氮量并且價格低廉,故常被不法商販添加到牛奶、奶粉等食品中提高含氮量[2],以造成高蛋白質(zhì)含量的假象,引發(fā)了一系列的食品安全問題,對人們健康造成了極大的危害和影響。三聚氰胺在進(jìn)入人體后會水解成三聚氰酸,三聚氰酸與三聚氰胺能形成不溶性的結(jié)晶復(fù)合物,從而導(dǎo)致膀胱炎、腎衰竭,嚴(yán)重甚至能導(dǎo)致尿石癥及膀胱癌[3]。傳統(tǒng)檢測牛奶中蛋白含量的凱氏定氮法只能測定氮的總量,卻并不能有效區(qū)分氮的來源和種類?，F(xiàn)有的三聚氰胺分析方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[4]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法[5,6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(GC-MS)法[7]、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[8-10]、表面增強拉曼光譜(SERS)法[11]等。這些方法需要昂貴而精密的儀器、專門訓(xùn)練的技術(shù)人員、檢測耗時長、成本較高。因此,建立一種簡便、快捷、低成本的檢測三聚氰胺的方法很有必要。

分子印跡技術(shù)(molecularly imprinted technique, MIT),是指以某一特定的目標(biāo)分子(模板分子、印跡分子)為模板,制備對該分子有特異選擇性識別能力的聚合物的技術(shù)[12],當(dāng)除去模板分子后,聚合物中就形成了與模板分子形狀和功能基團空間位置相匹配的具有多重作用點的印跡空穴,這些印跡空穴對模板分子具有特異識別性。光子晶體是指介質(zhì)材料在空間上按照一定的周期性順序排列形成的有序結(jié)構(gòu)材料,光子晶體的這種特殊的結(jié)構(gòu)對可見光的衍射服從布拉格衍射定律[13,14],布拉格衍射峰的波長受到介質(zhì)材料的折射率與晶格參數(shù)的影響,因此光子晶體可以作為傳感材料,在生物和化學(xué)傳感器方面有著很好的應(yīng)用前景[15,16]。將分子印跡技術(shù)與光子晶體結(jié)合,可以制備出同時具有二者優(yōu)點的材料。這種材料對目標(biāo)物分子具有特異性識別能力,同時光子晶體能夠?qū)⒎肿佑≯E聚合物同目標(biāo)分子結(jié)合的過程轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號[17-22]的檢測。

本研究利用單分散二氧化硅(SiO2)微球垂直沉降自組裝的方法獲得蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體模板,并選擇三聚氰胺作為模板分子,甲基丙烯酸(MAA)作為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)作為交聯(lián)劑,采用后填充的方法,經(jīng)紫外光引發(fā)聚合,再利用氫氟酸將二氧化硅蛋白石模版刻蝕下來,最終制備得到具有反蛋白石結(jié)構(gòu)的分子印跡光子晶體水凝膠膜(molecularly imprinted photonic hydrogels, MIPHs),實現(xiàn)了對三聚氰胺的檢測,對于食品及環(huán)境樣品中的三聚氰胺的檢測分析具有很好的應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UV-1800型紫外分光光光度計(日本SHIMADZU公司), DH-101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津中環(huán)實驗電爐有限公司), KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司), Acquity UPLC超高壓液相色譜儀(美國沃特世科技有限公司)。

單分散二氧化硅微球(直徑260 nm,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)購自北京市通廣精細(xì)化工公司;三聚氰胺(純度99.5%)、雙氰胺(純度99.0%)、三聚氰酸(純度99.0%)、丙烯酰胺(純度99.0%)均購自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;MAA(分析純)和EGDMA(純度98%)購自北京百靈威科技有限公司;偶氮二異丁腈(AIBN,分析純)購自上海市四赫維化工有限公司;辛烷磺酸鈉(純度99%)購自上海麥克林生化科技有限公司;檸檬酸(分析純)、濃硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、過氧化氫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)、氫氟酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥40%)均購自北京化工廠;無水甲醇(分析純)和無水乙醇(分析純)均購自北京試劑化學(xué)公司;乙腈(色譜純)購自中國Amthyst Chemicals公司。實驗用水為去離子水。色譜柱:COSMOSIL C18反相色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)。將載玻片裁成76 mm×8 mm×1 mm大小,并用純水超聲清洗,浸泡在H2SO4-H2O2(7∶3, v/v)混合液中24 h,后用去離子水洗滌3次,用氮氣吹干,得到親水化載玻片。將厚度約為1 mm的聚酯薄膜(PET)裁剪成75 mm×8 mm大小。

1.2 MIPHs的制備

利用垂直沉降自組裝的方法制備蛋白石結(jié)構(gòu)模板。將粒徑為260 nm的單分散SiO2微球均勻分散到無水乙醇中,配制成2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的膠體分散體系。將親水化載玻片基質(zhì)插入SiO2溶液中,采用垂直自組裝的方式,將其置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(30 ℃)。待乙醇揮發(fā)完畢,制備得到蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體模板。

將0.15 mmol三聚氰胺(19.92 mg)、14 mmol MAA(1 200 μL)、0.50 mmol EGDMA(100 μL)溶于2.0 mL甲醇-水(3∶2, v/v)中,配制成預(yù)聚液,超聲1 h使其充分混合,再通氮氣10 min以除去氧氣。然后向預(yù)聚液中加入20 mg引發(fā)劑AIBN,超聲10 min,取蛋白石光子晶體模版,在表面覆蓋一層75 mm×8 mm PET,形成下層為載玻片,中間為蛋白石光子晶體模板,上層為PET的結(jié)構(gòu)。將預(yù)聚合溶液采用后填充技術(shù)均勻鋪滿膜片與光子晶體的空隙。然后在365 nm紫外燈照射下紫外引發(fā)聚合3 h。

將上述聚合得到的光子晶體膜在質(zhì)量濃度為1%的氫氟酸中浸泡12 h,去除SiO2顆粒,得到反蛋白石結(jié)構(gòu)的MIPHs。采用甲醇-乙酸(3∶2, v/v)作為洗脫劑,將MIPHs置入洗脫劑中振蕩1 h,重復(fù)此步驟3次,以充分洗脫模板分子三聚氰胺。制備得到的MIPHs在去離子水中保存?zhèn)溆?。非分子印跡光子晶體水凝膠(non-molecularly imprinted photonic crystal hydrogels, NIPHs)制備方法除在預(yù)聚液中不加三聚氰胺外,其他步驟與上述方法相同,過程見圖1。

1.3 實際樣品的制備及檢測方法

奶粉樣品提取:稱取2 g奶粉,加入6 mL去離子水充分溶解,分4次加入4 mL乙腈,同時振蕩30 s,全部加完后充分振蕩5 min,以8 000 r/min的速度離心10 min,取上清液。于50 ℃用氮氣吹干,用6 mL去離子水溶解沉淀物,得到待測溶液。

色譜條件為流動相:乙腈-0.01 mol/L pH 3.3庚烷磺酸鈉溶液(1∶9, v/v);流速:1.0 mL/min;檢測波長:240 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL。

1.4 三聚氰胺MIPHs的表征

MIPHs的形貌用掃描電鏡進(jìn)行觀測。將MIPHs分別浸入濃度為10-11～10-6mol/L的待測溶液中,待穩(wěn)定后,取出MIPHs,使用紫外-可見分光光度計測定其紫外-可見吸收光譜,并記錄最大布拉格衍射峰波長。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIPHs的制備及檢測原理

制備蛋白石光子晶體模板是將載玻片以一定角度插入SiO2微球-乙醇膠體分散液,在微球顆粒毛細(xì)管力和乙醇蒸發(fā)所形成彎曲液面的表面張力作用下,SiO2微球會在玻璃基片上發(fā)生有序自組裝,形成規(guī)則排列的蛋白石結(jié)構(gòu)[23]。分子印跡光子晶體薄膜對目標(biāo)物的檢測原理符合布拉格衍射定律。三維大孔結(jié)構(gòu)的布拉格衍射方程為:

(1)

圖 2 (a)光子晶體模板與(b)MIPHs的掃描電鏡圖Fig. 2 SEM images of (a) the photonic crystal template and (b) MIPHs

2.2 MIPHs制備條件優(yōu)化

在極性環(huán)境下,以MAA為功能單體制備的水凝膠具有較好的分子識別能力及較寬的布拉格衍射峰位移,MAA可與模板分子形成較強的靜電相互作用和疏水相互作用,MAA可與三聚氰胺的氨基氫原子相互作用形成氫鍵。EGDMA具有較好的親水性,有利于水凝膠膜的形成。預(yù)聚液中水能夠影響聚合物的孔和表面積,水的量可能干擾氫鍵的形成和疏水相互作用,當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于10%時,氫鍵發(fā)揮重要作用。當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過65%時,疏水性相互作用是主要的影響[21],為了提高M(jìn)IPHs在水中的識別能力,以及考慮到三聚氰胺的溶解度,保證有足量的功能單體參與反應(yīng),確保結(jié)合位點充分形成,考察了制孔劑甲醇和水的體積比(7∶3, 3∶2, 1∶1, 2∶3),最終選擇甲醇-水(3∶2, v/v)為最佳致孔溶劑,此時MIPHs具有優(yōu)良的性質(zhì)。

單體與交聯(lián)劑的比例對MIPHs的三維結(jié)構(gòu)、強度、溶脹性能具有較大影響,交聯(lián)劑EGDMA含量對MIPHs形貌影響較大?？疾炝斯δ軉误w和交聯(lián)劑摩爾比為20∶1, 24∶1, 28∶1, 32∶1時制備的MIPHs的形貌和傳感性能。當(dāng)交聯(lián)劑含量較少時,膜的機械強度較差,膜易破碎,從SEM圖可以看出連接處會發(fā)生斷裂(見圖3a);若加入過多的交聯(lián)劑,膜的溶脹性能降低,表面會發(fā)生團聚,不能形成規(guī)整的有序排布大孔結(jié)構(gòu)(見圖3c),不能獲得有效光學(xué)信號。因此確定功能單體和交聯(lián)劑最佳摩爾比為28∶1,此時制得的MIPHs形貌如圖3b所示,MIPHs具有均勻規(guī)整的三維大孔結(jié)構(gòu),且表面平整,有利于獲得重復(fù)性好且穩(wěn)定的光學(xué)信號。

圖 3 不同MAA/EGDMA物質(zhì)的量比下制得MIPHs的SEM圖Fig. 3 SEM images of MIPHs prepared using different amount of substance ratios of methacrylic acid (MAA)/ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA)Amount of substance ratios of MAA/EGDMA: (a) 24∶1; (b) 28∶1; (c) 36∶1.

圖 4 MIPHs的傳感性能及顏色變化Fig. 4 Sensing abilities and color changes of MIPHs

2.3 MIPHs對三聚氰胺及其結(jié)構(gòu)類似物的檢測

對MIPHs和NIPHs對三聚氰胺的響應(yīng)情況進(jìn)行了考察。分別將MIPHs和NIPHs浸入濃度為10-11～10-6mol/L的三聚氰胺水溶液中,測定其布拉格衍射峰變化。如圖4所示,去離子水中MIPHs衍射峰為563 nm,隨著三聚氰胺濃度增大,MIPHs衍射峰逐漸紅移,最大為608 nm,同時膜的顏色由綠變紅。當(dāng)把NIPHs浸入三聚氰胺溶液中,衍射峰位移變化不明顯。這表明三聚氰胺印跡的MIPHs對于三聚氰胺有特異性識別作用,并且可以通過顏色變化以及光學(xué)信號分析的途徑對樣品中是否含有三聚氰胺進(jìn)行快速識別定性。作為對照,NIPHs由于不含有與三聚氰胺的結(jié)合位點,對三聚氰胺的結(jié)合為非特異性結(jié)合,結(jié)合量較少,所以在含有三聚氰胺的樣品中衍射峰位移變化很微小。采用紫外可見分光光度儀檢測衍射峰位移變化,在0.000 1 μmol/L三聚氰胺溶液中,MIPHs衍射峰即開始發(fā)生位移。若用裸眼觀測,0.01 μmol/L三聚氰胺溶液可以引起表觀顏色變化(見圖4)。則此MIPHs的檢出限估算為0.01 μmol/L,因此不論是使用紫外可見分光光度儀還是僅用裸眼觀測的檢出限均低于衛(wèi)生部公告中的限量值,即嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg,其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg[24]。

為了進(jìn)一步考察MIPHs對三聚氰胺的特異性識別能力,進(jìn)行了MIPHs的選擇性試驗。以入雙氰胺、三聚氰酸、丙烯酰胺作為三聚氰胺的結(jié)構(gòu)類似物,將MIPHs分別浸入不同濃度的雙氰胺、三聚氰酸、丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液中,并測定它們布拉格衍射峰的變化,每個濃度下重復(fù)測量5次,取平均值,測量最大偏差不超過2.5 nm。從圖5可以看出,MIPHs對結(jié)構(gòu)類似物及NIPHs對三聚氰胺均無響應(yīng),這表明制備的MIPHs對三聚氰胺具有較高的選擇性和靈敏度,可以用于樣品中目標(biāo)物的特異性識別分析。

圖 5 MIPHs的選擇性(n=5)Fig. 5 Selectivities of MIPHs (n=5)DCD: dicyanamide; AM: acrylamide; CYA: cyanuric acid.

2.4 MIPHs的動力學(xué)及重復(fù)利用性

本研究所制備的MIPHs具有三維孔洞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有著很高的比表面積,可以為待測分子提供充分的結(jié)合位點。同時因為孔狀結(jié)構(gòu)有利于分子擴散,所以待測物質(zhì)分子可以快速、高效與選擇性識別位點結(jié)合。如圖6a所示,在10-9mol/L的三聚氰胺水溶液中,MIPHs的最大衍射峰位置可以在45 s左右達(dá)到平衡,具有快速響應(yīng)的特性。

圖 6 MIPHs的(a)響應(yīng)速度和(b)重復(fù)性(n=5)Fig. 6 (a) Responding speeds and (b) recover abilities of MIPHs (n=5)

圖 7 MIPHs在奶樣品中的傳感性能Fig. 7 Sensing abilities of MIPHs in a milk sample

由于MIPHs是高度交聯(lián)的聚合物,具有良好的物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。MIPHs與待測分子是非共價作用結(jié)合的,可以用乙酸-甲醇(2∶3, v/v)進(jìn)行洗脫,然后在去離子水中平衡,恢復(fù)到空白狀態(tài)。試驗對制備的MIPHs的重復(fù)利用率進(jìn)行了測試,在5次洗脫/吸附循環(huán)中,利用同一個MIPHs對10-9mol/L的三聚氰胺水溶液進(jìn)行反復(fù)測定,結(jié)果如圖6b所示,在重復(fù)使用5次后,MIPHs對三聚氰胺仍有著良好的識別能力,表明MIPHs具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性,滿足實際使用時多次實驗分析的需要。

2.5 MIPHs在奶制品中的傳感性能

對MIPHs在奶制品中的傳感性能進(jìn)行了考察。奶制品采用上述2.3節(jié)方法進(jìn)行處理,并采用HPLC進(jìn)行分析,檢測結(jié)果表明樣品中不含三聚氰胺。MIPHs在空白奶制品溶液中無明顯響應(yīng),這表明MIPHs在奶制品中具有良好的抗干擾能力。將處理后的奶制品溶液加入三聚氰胺,使三聚氰胺濃度為0.005、0.01和0.015 μmol/L,再將MIPHs加入進(jìn)行檢測,MIPHs的布拉格衍射峰逐漸紅移(見圖7),顏色由綠變紅。三聚氰胺MIPHs在奶制品中仍具有高選擇性和高靈敏度的響應(yīng)能力,這表明此傳感器具有良好的實用性能。

3 結(jié)論

本文制備了MIPHs,并作為三聚氰胺的光學(xué)傳感器,實現(xiàn)樣品中三聚氰胺快速識別分析。這種傳感器成本低廉、操作簡單,并具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快、檢測時間短的特點,可以用于樣品中痕量三聚氰胺的快速識別,檢出限低于衛(wèi)生部[24]公告中的限量值。此外,由于MIPHs有明顯顏色變化,可對三聚氰胺進(jìn)行裸眼識別,從而快速定性檢測,進(jìn)一步降低了檢測成本和操作要求,滿足對一些樣品快速定性分析的要求。制備的MIPHs還具有穩(wěn)定性高,重復(fù)利用性好的優(yōu)點,可以作為一種有效工具用于食品中有害成分或環(huán)境污染物的快速分析檢測。