彭 勝, 李 奐, 施樹云,*

(1. 吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實驗室, 湖南 張家界 427000; 2. 吉首大學(xué)杜仲綜合利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室, 湖南 吉首 416000; 3. 中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 長沙 410083)

綠原酸(chlorogenic acid, CGA)廣泛存在于蕨類植物到高等雙子葉植物及相關(guān)的中成藥中,具有抗氧化、抗菌、抗病毒、消炎、降脂、護(hù)肝和神經(jīng)保護(hù)等方面的功效[1]。CGA是眾多中藥及其制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)之一,因此建立CGA準(zhǔn)確靈敏的定性定量分析方法至關(guān)重要。

目前定性及定量分析的常用方法是高效液相色譜法(HPLC),但是考慮到中藥及其相關(guān)產(chǎn)品成分復(fù)雜,在HPLC分析之前有必要對樣品進(jìn)行預(yù)處理[2]。固相萃取因高富集因子、操作簡便等優(yōu)勢被廣泛使用,反相C18、SiO2、金屬氧化物、碳基吸附劑和聚合物吸附劑是常用的固相萃取吸附材料[3]。其中,分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)具有構(gòu)效預(yù)定性、特異識別性和廣泛實用性等優(yōu)勢,可用于復(fù)雜體系中目標(biāo)組分的高效特異性分離富集,并消除基質(zhì)干擾[4-8]。迄今,科研工作者在MIPs的合成和應(yīng)用方面已做出了卓有成效的工作,多數(shù)MIPs是在有機(jī)溶劑或非極性溶劑中,氮?dú)獗Ｗo(hù)下,通過模板分子與烯丙基功能單體(如甲基丙烯酸、丙烯酰胺、乙烯基咪唑等)及交聯(lián)劑共聚而成,合成的MIPs在非極性溶劑中具有良好的特異性識別性能[9]。同時表面印跡技術(shù)的應(yīng)用也使印跡位點(diǎn)位于MIPs的表面,增強(qiáng)吸附性能,如已在磁性Fe3O4、中空纖維、納米TiO2、石墨烯碳納米管等表面成功地合成了基于CGA特異性吸附的MIPs[10-14]。但該類MIPs在水溶液中非特異性吸附強(qiáng),而常見的中藥制劑、食品、生物制品等均是水溶液體系,因此設(shè)計水體系中具特異性識別性能的MIPs勢在必行。

本文以CGA為模板、間苯二酚和三聚氰胺為雙功能單體、甲醛為交聯(lián)劑、磁性介孔二氧化硅(Fe3O4@mSiO2)為載體合成了親水性磁性MIRs(magnetic MIRs, MMIRs)。優(yōu)化了合成條件,研究了MMIRs的靜態(tài)、動態(tài)和選擇性吸附性能,并結(jié)合HPLC用于杜仲黑茶中CGA的選擇性分離和含量檢測。結(jié)果表明該方法簡便、快速,在水體系中的選擇性識別性能好。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

安捷倫1200高效液相色譜系統(tǒng)(在線脫氣機(jī)、四元泵、恒溫柱溫箱、自動進(jìn)樣器和二極管陣列檢測器) (Agilent Technologies, USA); Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀(Thermo Nicolet Co., USA); JEM-2100F透射電子顯微鏡(JEOL, Japan); JC2000D1接觸角測量儀(上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司,上海); VSM7407振動樣品磁強(qiáng)計(Lake Shore, USA); SDTQ600熱重分析儀(TA, USA); Milli-Q超純水儀(Bedford, USA)。

三聚氰胺、間苯二酚、甲醛、聚乙二醇6000(PEG 6000)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、正硅酸四乙酯(TEOS)、氫氧化鈉(NaOH)、三氯化鐵(FeCl356H2O)、甲醇和乙醇均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海); HPLC級甲醇和乙酸購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司(上海); CGA、咖啡酸(caffeic acid, CA)、阿魏酸(ferulic acid, FA)、肉桂酸(cinnamic acid, CMA)對照品購自西亞試劑有限公司(山東)。

杜仲黑茶由張家界茶坤緣生物科技開發(fā)有限公司提供。

1.2 MMIRs的制備

圖1為MMIRs的合成示意圖。首先合成Fe3O4@mSiO2,步驟同課題組前期研究[7]。接著將間苯二酚(3 mmol)和甲醛(6 mmol)溶于超純水(30 mL), 40 ℃下磁力攪拌1 h形成A溶液;將三聚氰胺(1 mmol)和甲醛(3 mmol)溶于超純水(10 mL), 80 ℃下磁力攪拌至透明,冷卻至室溫形成B溶液。然后將Fe3O4@mSiO2(100 mg)、A溶液、B溶液和CGA溶液(0.04 mol/L, 10 mL)混合,80 ℃恒溫機(jī)械攪拌反應(yīng)3 h。磁分離Fe3O4@mSiO2/MIRs后,水洗3次,將其分散于NaOH水溶液(50 g/L, 20 mL)中攪拌除去mSiO2和CGA。最后,磁分離MMIRs,用水洗至中性,40 ℃真空干燥至恒重。

親水性磁性非分子印跡樹脂(magnetic non-molecularly imprinted resins, MNIRs)的制備除了不加模板CGA外,所有步驟同MMIRs的合成。

圖 1 MMIRs合成示意圖Fig. 1 Synthetic route for preparing MMIRs

1.3 HPLC分析

Waters SunFire-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, Waters);流動相為0.4% (v/v)乙酸(A)和甲醇(B),梯度洗脫:0～10 min, 12%B; 10～16 min, 12%B～18%B; 16～25 min, 18%B;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;流速:0.8 mL/min;檢測波長:254 nm。

1.4 吸附實驗

吸附動力學(xué):準(zhǔn)確稱取若干份MMIRs(MNIRs) (10.0 mg),分別加入到CGA(1.4 g/L)的50%(v/v,下同)乙醇水溶液(5.0 mL)中,于25 ℃下200 r/min振蕩吸附,在不同的時間點(diǎn)(10～100 min)取出,使用HPLC方法檢測CGA的質(zhì)量濃度Ct(g/L)。由方程(1)計算出MMIRs(MNIRs)對CGA的吸附量Qt(mg/g):

在現(xiàn)場環(huán)境監(jiān)測階段，有很多不確定性，這些問題多多少少會對數(shù)據(jù)收集的精準(zhǔn)度帶來影響，要想避免環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)受到破壞，就要對監(jiān)測人員提出質(zhì)量控制請求，在采樣工作中，要有專業(yè)監(jiān)控人員指導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)問題及時解決，確保環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)收集行為的規(guī)范性。

(1)

式中m(g)表示MMIRs(MNIRs)的質(zhì)量,C0(g/L)和V(mL)分別是CGA溶液的初始濃度和體積。

靜態(tài)吸附:準(zhǔn)確稱取若干份MMIRs(MNIRs) (10.0 mg),分別加入到含不同質(zhì)量濃度CGA(0.4～1.6 g/L)的50%乙醇溶液(5.0 mL)中,于25 ℃下200 r/min振蕩吸附70 min,使用HPLC方法檢測CGA的平衡濃度Ce(g/L)。由方程(2)計算出MMIRs(MNIRs)對CGA的平衡吸附量Qe(mg/g):

(2)

選擇性吸附:選擇模板分子CGA和3個結(jié)構(gòu)類似物CA、FA和CMA,準(zhǔn)確稱取4份MMIRs(MNIRs) (10.0 mg),分別加入到含CGA、CA、FA和CMA的50%乙醇溶液中(1.4 g/L, 5.0 mL),于25 ℃下200 r/min振蕩吸附70 min,使用HPLC方法檢測平衡時CGA、CA、FA和CMA的質(zhì)量濃度,使用方程(2)計算平衡吸附量。

1.5 杜仲黑茶中綠原酸的檢測

杜仲黑茶粉碎,稱取10.0 g杜仲黑茶粉末于100 ℃下用50%乙醇溶液(80.0 mL)回流提取3次,每次提取2.0 h,合并提取液后抽濾并減壓濃縮至干燥,得3.4 g浸膏。將MMIRs (20 mg)加入到杜仲黑茶的50%乙醇溶液中(3.0 g/L, 5 mL),混合物在25 ℃下于200 r/min振蕩吸附70 min,磁分離MMIRs,水洗3次除去非特異吸附成分,然后用甲醇-水-醋酸(3∶1∶1, v/v/v, 5 mL)洗脫,并用HPLC分析洗脫液。

2 結(jié)果與討論

2.1 MMIRs的合成和表征

MMIRs的合成過程中采用Fe3O4@mSiO2為載體,CGA、間苯二酚、三聚氰胺和甲醛在mSiO2的介孔中共聚生成MIRs,無需對mSiO2表面進(jìn)行官能團(tuán)修飾,最后通過NaOH刻蝕掉mSiO2和模板分子得到MMIRs。N2吸附和解吸附實驗顯示MMIRs的孔徑為2.95 nm,表明MMIRs具有多孔結(jié)構(gòu)、印跡位點(diǎn)位于材料表面。模板分子CGA的加入量及印跡時間對MMIRs的印跡效果影響較大,少量CGA導(dǎo)致識別位點(diǎn)少,然而過量的CGA會和功能單體形成無序自組裝;共聚時間的增加會增厚印跡層,從而導(dǎo)致印跡位點(diǎn)的包埋及吸附量的降低。實驗中考察了不同CGA的加入量以及不同共聚時間對MMIRs吸附量的影響,最終確定CGA的加入量為0.4 mmol,共聚時間為3 h,合成的MMIRs對CGA具有較好的吸附行為。

圖 2 (a)Fe3O4@mSiO2/MIRs和(b)MMIRs的透射電子顯微鏡(TEM)圖Fig. 2 Transmission electron microscopy (TEM) images of (a) Fe3O4@mSiO2/MIRs, and (b) MMIRs

圖2為Fe3O4@mSiO2/MIRs和MMIRs的透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)圖,Fe3O4@mSiO2/MIRs的平均粒徑約200 nm,其中殼層厚度30 nm左右[7]。除去mSiO2后,MMIRs呈現(xiàn)疏松多孔的核殼結(jié)構(gòu),外部MIRs層薄約6 nm。Fe3O4、Fe3O4@mSiO2、Fe3O4@mSiO2/MIRs和MMIRs的紅外光譜如圖3所示,圖3a中576 cm-1為Fe-O強(qiáng)的伸縮振動峰,圖3b中新增Si-O鍵在1 089和461 cm-1的振動峰,在2 980 cm-1左右未見明顯的C-H吸附峰,表明CTAB的完全除去和Fe3O4@mSiO2的成功合成;圖3c中,寬而強(qiáng)的3 405 cm-1來自O(shè)-H和N-H的伸縮振動峰,812 cm-1為N-H的面外彎曲振動,1 346 cm-1和1 559 cm-1來自三聚氰胺中C-N的彎曲振動和伸縮振動,1 160 cm-1是C-O-C的伸縮振動;圖3d中,未見1 089 cm-1和461 cm-1的吸收峰,顯示mSiO2的完全除去。結(jié)果表明MMIRs成功合成。

圖 3 (a)Fe3O4, (b)Fe3O4@mSiO2, (c)Fe3O4@mSiO2/MIRs和(d)MMIRs的紅外光譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of (a)Fe3O4, (b)Fe3O4@mSiO2, (c)Fe3O4@mSiO2/MIRs, and (d)MMIRs

圖 4 MMIRs的(a)熱重分析,(b)磁滯回線和(c)水滴的輪廓圖Fig. 4 (a) Thermogravimetric analysis, (b) hysteresis loop, and (c) profile of a water drop on MMIRs

熱重分析(圖4a)顯示溫度升高到800 ℃時質(zhì)量損失60%,源于MIRs層的分解;磁滯回線(圖4b)顯示MMIRs的磁飽和強(qiáng)度為40.6 emu/g,實驗中MMIRs在外加磁場的作用下5 s內(nèi)可實現(xiàn)磁分離,撤除外加磁場后能快速分散,說明制備的MMIRs具有超順磁性、高磁響應(yīng)性的特點(diǎn);水滴與MMIRs接觸2 s內(nèi)迅速鋪展,接觸角為4.50°(圖4c),表明MMIRs具有極強(qiáng)的親水性。因此,MMIRs可實現(xiàn)水體系中目標(biāo)化合物的快速選擇性分離。

2.2 MMIRs(MNIRs)對CGA的吸附

MMIRs(MNIRs)對CGA的吸附動力學(xué)曲線如圖5a所示,隨著時間的延長吸附量逐漸增大,MMIRs在70 min時對CGA的吸附達(dá)到飽和,而MNIRs在40 min時就趨于飽和吸附,MMIRs對CGA的吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于MNIRs,主要原因為MMIRs存在CGA的特異性吸附位點(diǎn),而MNIRs為表面分子間的氫鍵或靜電作用。前期關(guān)于MIRs的合成報道中,聚合時間為24 h左右,平衡吸附時間為10～12 h[18-23]。因此,表面多孔MIRs層結(jié)構(gòu)以及適宜的MIRs層厚度可以使印跡位點(diǎn)位于表面,加快吸附速率。

MMIRs(MNIRs)對CGA的靜態(tài)吸附曲線如圖5b所示,隨著CGA質(zhì)量濃度的增加吸附量逐漸增加,在質(zhì)量濃度大于1.4 g/L時吸附達(dá)到平衡,MMIRs對CGA的平衡吸附量(50.87 mg/g)是MNIRs平衡吸附量(9.71 mg/g)的5.24倍,表明了MMIRs對CGA的特異性吸附。迄今,文獻(xiàn)報道的基于CGA的MIPs合成均為非水體系,在乙腈等非質(zhì)子性溶劑中具備選擇性吸附性能[10-14]。本文合成了在水體系中具有高特異性吸附的印跡材料。

圖 5 MMIRs(MNIRs)對CGA的(a)動態(tài)吸附和(b)靜態(tài)吸附等溫線(n=3)Fig. 5 (a) Kinetic adsorption and (b) equilibrium adsorption curves of CGA on MMIRs(MNIRs) (n=3)

圖 6 MMIRs(MNIRs)對CGA、CA、FA和CMA的吸附容量(n=3)Fig. 6 Adsorption capacities of CGA, CA, FA, and CMA on MMIRs/MNIR (n=3)

MMIRs(MNIRs)對CGA、CA、FA和CMA的平衡吸附結(jié)果如圖6所示,MMIRs對CGA的吸附容量(50.87 mg/g)是CA(12.05 mg/g)的4.22倍,FA(16.79 mg/g)的3.03倍,CMA(14.18 mg/g)的3.59倍;CGA、CA、FA和CMA在MNIRs上的吸附容量差異不大。結(jié)構(gòu)的差異性會影響吸附能力,說明印跡孔穴與CGA的互補(bǔ)性。

MMIRs對CGA吸附的穩(wěn)定性至關(guān)重要,合成了5批MMIRs,其吸附量的RSD值為6.4%,說明了批間的穩(wěn)定性;考察了10次連續(xù)吸附-解吸附的實驗結(jié)果,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,MMIRs對CGA的吸附能力輕微下降,10次循環(huán)后吸附量為原先的91.5%,表明MMIRs對CGA吸附的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性能。

2.3 MMIRs-HPLC方法的建立

配制系列CGA標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用MMIRs進(jìn)行吸附-解吸附實驗,HPLC分析檢測CGA,在2.0～200.0 mg/L范圍內(nèi)得到CGA的線性方程為Y=52.06X-19.92(R2=0.999 3),其中Y和X分別是CGA的HPLC峰面積和質(zhì)量濃度(mg/L)。CGA的檢出限(信噪比S/N=3)為0.7 mg/L,定量限(信噪比S/N=10)為1.6 mg/L。方法的加標(biāo)回收率為93.1%～109.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.6%。說明該方法可滿足CGA的測定要求。

2.4 實際樣品檢測

將MMIRs-HPLC方法用于杜仲黑茶中CGA的測定,圖7為杜仲黑茶經(jīng)過MMIRs固相萃取前后的HPLC譜圖,經(jīng)過MMIRs選擇性固相萃取后,基本不存在其他干擾性物質(zhì)。最終,測得杜仲黑茶中CGA的含量為(2.79±0.18) mg/g,結(jié)果與文獻(xiàn)[14]報道一致,表明MMIRs選擇性萃取分離結(jié)合HPLC分析檢測可用于實際復(fù)雜體系中CGA的特異性分析。

圖 7 杜仲黑茶經(jīng)MMIRs萃取(a)前、(b)后的HPLC譜圖Fig. 7 HPLC chromatograms of Duzhong brick tea (a) before and (b) after extraction with MPMIPs

3 結(jié)論

本文以CGA為模板、間苯二酚和三聚氰胺為雙功能單體、甲醛為交聯(lián)劑、磁性介孔二氧化硅為載體合成了親水性MMIRs。mSiO2的多孔結(jié)構(gòu)提供了MIRs的聚合場所和多孔結(jié)構(gòu),簡化合成過程、增加吸附容量、加快吸附速率。MMIRs對CGA表現(xiàn)出良好的吸附選擇性,結(jié)合HPLC分析用于杜仲黑茶中CGA的測定,排除復(fù)雜基質(zhì)的干擾,提高分析的準(zhǔn)確度。MMIRs在水體系中的特異性吸附性能使其可作為新型吸附材料用于生物、環(huán)境和臨床領(lǐng)域的研究中。