熊李波，秦 強，胡培芳，郭 佳，夏泆斌，張 忠,*，畢 陽,*，葛向珍

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省蘭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督管理中心，甘肅 蘭州 730030）

植物精油是從草本植物的花、苞、葉、枝、根、樹皮、果實、種子和樹脂等中，以蒸餾或壓榨等方式提煉出來的特有的芳香味油狀液體[1-3]。研究報道植物精油具有廣譜的抗微生物活性，能夠抑殺細菌、真菌和病毒[4-6]。精油作為天然提取物，是新興的具有良好抑菌效果的抑菌劑[7-8]，利用單一精油組合的協(xié)同性和加和性是提高精油抗菌功效的新方法[9]。近年來由于化學合成防腐劑的使用對消費者的健康和環(huán)境產(chǎn)生不利的影響；同時細菌、真菌等食源性微生物的耐藥性問題也已引起了世界各國的廣泛關(guān)注[10-11]。因此，開發(fā)研究天然混合精油抑菌藥物越來越受到科研工作者的關(guān)注。

采后病害是導致果蔬供應鏈中經(jīng)濟損失的主要因素之一，可能發(fā)生在供應鏈的各個環(huán)節(jié)，如采收、分級、包裝、運輸、貯藏等，同時采后果蔬侵染病害中的一些真菌病原物能夠產(chǎn)生毒素，對人體健康產(chǎn)生潛在危害[12]。精油作為芳香植物體中提取的揮發(fā)性混合化合物，具有抑菌活性和抗氧化性，被認為是天然環(huán)保的控制食源性致病微生物的抗菌藥物替代品[13-14]。研究表明植物精油的主要成分為萜烯、醇、酯、醛、酚類和一些含烴類化合物[15]，不同精油之間不同類型的化合物含量存在差異，且不同類型的化合物抑菌活性不同，從而導致抑菌效果差異顯著；混合植物精油由于化合物之間的組合相互作用，對目標菌株具有多靶點抑菌作用[16]。據(jù)報道，食品需要高濃度精油才能達到較佳的抑菌效果[9,17]，但這些高濃度的精油則會改變食物感官特性或者產(chǎn)生毒性[1,9,18]，為了減少精油的有效劑量并提高其抑菌效果，研究表明可以將不同精油進行組合[19-20]；因此本實驗通過測定試用菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）、最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）和菌落直徑，利用單純型增強質(zhì)心混料設計數(shù)學模型設計3 種植物精油混合作用下對4 種果蔬真菌的最優(yōu)混料比例，以實現(xiàn)在較低精油用量下較優(yōu)的抑菌效果，為天然抑菌劑減量使用提供方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆孜然采購于甘肅敦煌種業(yè)有限公司；大紅袍花椒購于甘肅省天水市張家川回族自治縣；黃芥子采購于安徽亳州市中藥材市場。

葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉、Tween-80、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 北京Solarbio公司。

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）、擴展青霉（Penicillium expansum）、互隔交鏈孢（Alternaria alternata）、硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）分離自發(fā)病果實，保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學采后生物學與技術(shù)實驗室。

1.2 儀器與設備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9245A型電熱鼓風箱、DHP-9162型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FS1C生物顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司；CN69M/FW80高效植物樣品粉碎機 北京中西遠大科技有限公司；GC6890N/MS5973N型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 精油的制備及GC-MS分析

采用水蒸氣蒸餾法制備精油，收集精油后用無水硫酸鈉干燥，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

參照李偉等[21]的方法，GC條件：HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 mh250 μm，0.25 μm）。柱溫：65～250 ℃程序升溫。初始溫度為65 ℃，保持5 min；以8 ℃/min的速率升至180 ℃，保持2 min；再以20 ℃/min的速率升至250 ℃，保持2 min。載氣為高純氮氣，柱流量為1.0 mL/min，以分流方式進樣，分流比為20∶1，進樣口溫度為250 ℃。質(zhì)譜條件：采用電子電離方式，電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度230 ℃，溶劑采集方式Scan，容劑遲延時間4.2 min。間隔時間0.3 s，開始采集時m/z 50，結(jié)束時m/z 550，進樣量0.2 μL。采用NIST02.1標準質(zhì)譜庫進行檢索、分析。

1.3.2 植物精油抑菌效力測定

1.3.2.1 培養(yǎng)基的制備

分別配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基待用（自然pH值）。

1.3.2.2 孢子懸浮液的配制

分別取25 ℃下培養(yǎng)7 d的4 種真菌（粉紅單端孢、擴展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌）培養(yǎng)皿，加入含有體積分數(shù)為0.05% Tween-80的無菌水約10 mL，用玻璃涂布棒刮下平板上的真菌孢子，然后轉(zhuǎn)入50 mL的三角瓶中，4 層紗布過濾，充分振蕩后，濾液用血球計數(shù)器計數(shù)，稀釋至濃度為1h106～3h106個/mL備用。

1.3.2.3 菌落直徑的測定

采用瓊脂紙片擴散法測定抑菌活性，參考Cakir等[22]的方法并略作修改，使用直徑9 cm的培養(yǎng)皿，每皿加入20 mL的PDA培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌金屬打孔器（d＝8 mm）在平板中央處打一小孔，去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，再用移液槍吸取一滴未凝固的PDA培養(yǎng)基溶液封底，待到孔內(nèi)瓊脂凝固后，加入5 μL菌懸液至完全吸收后將平板倒置，用無菌鑷子取一濾紙片（d＝25 mm）置于皿蓋中央，在濾紙上加入100 μL無菌水，再加入3 μL精油，以不添加精油的設為空白對照，每次實驗重復3 次。以上操作均在無菌條件下進行，然后在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育72 h。采用十字交叉法測定菌落直徑，結(jié)果取其平均值，菌落直徑越大則說明該種精油對此真菌的抑菌效果越差，反之則抑菌效果越好。

1.3.2.4 MIC和MBC測定

通過采用微量稀釋法測定每種菌株的MIC和MBC，參考Haba[23]和Tian Jun[24]等的方法并略作修改。使用24 微孔板培養(yǎng)，分別配制所需濃度，每孔板分別依次加入1.9 mL含Tween-80（體積分數(shù)0.01%）和精油的PDB培養(yǎng)基、80 μL菌懸液，最后加入20 μL指示劑MTT（0.5 mg/mL）溶液，并略微振動10 min至混勻，然后將微孔板置于28 ℃下恒溫孵育24～28 h。在孵育期后，觀察孔板中指示劑（MTT）溶液顏色變化情況，并評估菌株生長活性，將MIC視為最低精油抑菌濃度，測定并記錄MIC，為防止MTT指示劑顏色變化，繼續(xù)孵育至72 h，測定MBC，MBC對應于在28 ℃孵育72 h后不產(chǎn)生培養(yǎng)物的精油為最低殺菌濃度，實驗每次重復3 次進行。

1.3.2.5 混料設計

為了評估精油的一元、二元、三元混合抑菌效果，使用單純型增強質(zhì)心混料設計[25]，每種精油所占混合物的百分比范圍為0～1，對設計空間比例無限制。

混料實驗設計的要點是三角形的3 個頂點（1、2、3）（分別對應于3 種植物精油）、三邊中點（4、5、6）、中心點（重心7）和3 個增強點（8、9、10）由三元組合的二進制設計組成（圖1）；每種真菌的完整實驗設計包括21 個實驗（表1），其中包含3 個中心點的增強設計，本實驗以隨機順序進行。

圖1 三元混合物的單純型增強質(zhì)心混料設計圖Fig.1 Schematic diagram of enhanced simple-centroid mixture design

表1 不同菌株MIC測定的混料設計矩陣和實驗響應值Table1 Mixture design matrix with experimental MICs against different strains

因變量是對4 種果蔬真菌粉紅單端孢、擴展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌的抑菌效果，通過1.3.2.4節(jié)所述的微量稀釋法測得MIC，然后將數(shù)據(jù)擬合并應用最小二乘回歸的特殊三次多項式模型中，以預測方程式中的未知系數(shù)。

式中：Y是響應值；bx是單組分響應值效應大小；bxy是雙組分響應值效應的大??；bxyz是3 個組分對響應值交互效應的大小；Xx表示混合物中組分的比例。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗數(shù)據(jù)分析及響應面圖采用Minitab 17軟件處理，用Duncan’s法進行多重顯著性分析和標準偏差計算，菌落直徑柱狀圖采用Origin 9.1軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油的提取率及組分分析

從孜然、花椒、芥子原料中提取的精油含量分別為2.29、2.52、1.12 mL/g。

通過GC-MS分析，孜然精油檢測48 種化合物，占總量的99.93%（質(zhì)量分數(shù)，下同），主要成分為枯茗醛（21.89%）、β-蒎烯（20.49%）、γ-萜品烯（18.37%）、4-丙-2-環(huán)己基-1,4-二烯-1-甲醛（10.98%）、p-傘花烴（8.89%）、4-丙-2-環(huán)己基-3-烯-1-甲醛（7.95%）；據(jù)Teneva等[26]報道孜然精油中的25 種化合物主要包括枯茗醛（30.834%）、3-蒈烯-10-醛（17.223%）、β-蒎烯（14.837%）、γ-萜品烯（11.928%）、2-蒈烯-10-醛（8.228%）和p-傘花烴（6.429%）；同時李大強[27]報道中國新疆和甘肅的孜然精油主要由萜類化合物組成，包括萜醛、萜烯、萜醇，從化合物種類來看，兩地精油的主要成分均有2-蒈烯-10-醛、枯茗醛、3-蒈烯-10-醛、γ-松油烯、p-傘花烴、α-蒎烯等。

花椒精油檢測出43 種化合物，占總量的95%，主要成分為芳樟醇（15.05%）、雙戊烯（11.79%）、乙酸芳樟酯（11.17%）、β-蒎烯（9.33%）、（－）-4-萜品醇（6.04%）、桉葉油醇（4.62%）；唐裕芳等[28]的研究發(fā)現(xiàn)花椒精油中主要有22 種化學成分，包括烯醇（芳樟醇29.69%、4-松油醇10.79%、α-松油醇8.35%）及其酯類衍生物（芳樟醇酯36.89%）、萜烯類化合物6.76%（β-月桂烯、（＋）-2-蒈烯、檸檬烯、α-側(cè)柏烯、順-α-羅勒烯、γ-松油烯、α-石竹烯）、苯酚、桉葉油素等主要成分。

芥子精油檢測出22 種化合物，占總量的99.97%，主要成分為烯丙基異硫氰酸酯（50.97%）、4-異硫氰基-1-丁烯（44.91%）；陳密玉等[29]報道芥子精油的主要化學成分為烯丙基異硫氰酸酯（35.897%）、4-異硫氰基-1-丁烯（57.658%），這兩種化合物的相對含量占總含量的93.555%，由此可見，芥子精油是以含有異硫氰基化合物為主的混合物。

總體而言，植物精油是一類含有烴類與其他物質(zhì)（如萜烯、醇、酯、醛和酚類化合物）的混合物，其中萜烯、醇、酯、醛和酚類化合物具有抑菌活性[15]；由植物精油提取出的化合物組合可能受植物品種、氣候條件、地理區(qū)域及植物收集季節(jié)的影響[30]，造成不同報道之間同種精油的組分存在部分差異。

2.2 單一精油的抑菌效果

表2 3 種精油對4 種果蔬真菌的抑菌活性Table2 Antimicrobial activity of three essential oils against four fungi

所測試的精油通過微量稀釋方法和瓊脂紙片擴散法來測定其抑菌效果（表2、圖2），在測試的菌株中，互隔交鏈孢的耐藥性最強（MBC≥2.0 μL/mL），且孜然、花椒精油不能在2.0 μL/mL條件下殺死該菌株；相反，硫色鐮刀菌相比于其他3 種菌株是最敏感的菌株；從菌落直徑和MIC可以看出，芥子精油相比于孜然精油、花椒精油，其對4 種菌株均具有較強的抑菌效果，且花椒精油的抑菌效果最弱。根據(jù)每種菌株在不同精油處理組間顯著性分析可知，混合精油和單種芥子精油處理后抗菌效果最佳；互隔交鏈孢相比于其他3 種菌株菌落直徑較大、活力最強，但芥子精油對其抑菌效果最佳，這可能與精油的化學成分組成和所測目標菌株的種類有關(guān)，芥子精油所含的異硫氰基化合物的質(zhì)量分數(shù)達到95.88%，而孜然、花椒精油所含的萜類、醇類、酯類和酚類化合物相對復雜，且各物質(zhì)含量相對比例較少。據(jù)報道，不同的植物精油對同一種菌的抑制活性不同，如丁香精油、百里香酚和蒔蘿精油對鏈格孢菌的MIC分別為600 μg/mL、2 μL/mL和0.5 μL/mL[31-33]；同一種精油對不同菌種的抑制效果也存在差異，亞香茅精油對炭疽菌的抗性很強，當添加量達到0.2%時平板中沒有檢出菌落，對柯柯豆毛色二孢的抑制作用較差，添加量為2%才可以完全抑制菌的生長[34]。由此可知，抑菌強弱與所用精油和所測目標菌株種類有關(guān)。

表3 不同菌株在混合精油處理下的響應模型方差分析Table3 Analysis of variance for the antifungal activity of oil blends against different strains

圖2 不同處理方式下菌株的菌落直徑Fig.2 Diameters of inhibition zones of fungal strains when exposed to individual and blended essential oils

2.3 三元混合物及其抑菌作用

研究混合精油之間相互抑菌作用較為復雜，要根據(jù)混合精油比例關(guān)系和其化合物組成成分進行量化分析，才能確保結(jié)果的可靠性。棋盤和時間抑菌法曲線是評估混合精油抑菌效果的最常用的方法[9,35-36]，但其無法得出最佳的混合比以及擬合出最佳混合響應值。因此，本實驗采用單純型增強質(zhì)心混料設計數(shù)學模型預測3 種混合精油（孜然精油、花椒精油、芥子精油）對4 種果蔬真菌（粉紅單端孢、擴展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌）的抑菌效果。

2.3.1 建立響應預測模型

通過1.3.2.5節(jié)方法，對實驗數(shù)據(jù)進行單純型增強質(zhì)心混料設計響應分析（表1），并為每種菌株建立響應預測方程，通過特殊立方模型描述響應變量與因子之間的關(guān)系，確定系數(shù)R2和調(diào)整后的系數(shù)R2分析所選模型數(shù)據(jù)擬合的最佳組合（表3），再根據(jù)統(tǒng)計學方差分析確定最優(yōu)回歸模型（表3）。通常擬合模型系數(shù)為負表示降低因子響應變量能力，為正表示增強因子響應變量能力。本研究應用混料設計數(shù)學模型的目的是提高混合精油抑菌聯(lián)合作用，即最小響應變量（MIC），因此，系數(shù)為負表示混合精油相關(guān)因素增加抗菌作用的能力。

2.3.2 混合精油相互作用的影響

據(jù)報道，不同的化合物相互作用可以提高或者降低精油的抑菌效果[9]。其相互作用可以產(chǎn)生4 種類型的效果：無關(guān)、相加、拮抗和協(xié)同作用。

圖3 3 種精油對4 種果蔬真菌在不同植物精油組合作用下響應的MIC 2D、3D輪廓圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of interaction between essential oils on MICs against four fungi

表4 不同模型系數(shù)擬合值及差異顯著性水平分析Table4 Response coeff i cients and signif i cance test

從表4和圖3中可以看出，芥子精油的響應系數(shù)最小，其次是孜然精油，花椒精油的響應系數(shù)較大，這一發(fā)現(xiàn)也反映出3 種精油抑菌能力的強弱，精油之間的相互作用程度可能與精油組成成分和受試菌株有關(guān)[16]。孜然精油和花椒精油對硫色鐮刀菌表現(xiàn)出高度顯著的協(xié)同抑菌作用（P＜0.001），而對互隔交鏈孢菌沒有發(fā)現(xiàn)顯著的協(xié)同作用（P＞0.05），然而，這兩種精油對粉紅單端孢和擴展青霉的響應系數(shù)為正，相比另外兩種真菌具有相對較弱的抑菌能力，表現(xiàn)出極顯著的拮抗作用（P＜0.01），據(jù)報道酚類單萜與醇類的組合會對部分微生物產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用[37]；孜然精油和芥子精油對硫色鐮刀菌具有高度顯著的協(xié)同抑菌作用（P＜0.001），對粉紅單端孢、擴展青霉和互隔交鏈孢不能確定協(xié)同或拮抗抑菌作用（P＞0.05）；花椒精油和芥子精油對擴展青霉、互隔交鏈孢和硫色鐮刀菌具有顯著的協(xié)同抑菌效應（P＜0.05），這一結(jié)果可能與花椒精油的主要成分醇類、酯類和芥子精油的主要成分異硫氰基化合物之間的化學組成成分相互作用有關(guān)。當3 種精油混合作用時，發(fā)現(xiàn)均顯示負響應系數(shù)，表明對4 種真菌均具有較強的抑菌作用，對粉紅單端孢、擴展青霉、硫色鐮刀菌均具有高度顯著的協(xié)同抑菌作用（P＜0.001），且擴展青霉、硫色鐮刀菌響應值（MIC）距三角形最佳混合區(qū)域中心較接近（圖3B1、D1），表現(xiàn)出較優(yōu)混合精油組合下的抑菌效果最佳，這一結(jié)果可能與混合精油各化學成分相互作用的原因有關(guān)。由于精油的生物活性與其化學成分直接相關(guān)，即使是在同一精油內(nèi)也可能發(fā)生顯著的變化，導致這些差異性來源可能包括提取的植物部位、植物的生長氣候以及生長環(huán)境條件[38-39]。精油的生物活性也受其組成組分之間相互作用的影響，即使含量較小的化合物也會由于其化學類別的不同，導致其產(chǎn)生協(xié)同作用、拮抗或相加作用的化學反應[15,38,40-41]。

Pekmezovic等[42]利用動力學模型研究百里香、肉桂精油混合作用對黃曲霉菌的抑菌效果，結(jié)果表明其混合精油對黃曲霉菌具有協(xié)同性和加和性；de Azeredo等[43]發(fā)現(xiàn)牛至精油和迷迭香精油對單核增生性李斯特菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌具有協(xié)同作用；此外Ghabraie等[44]研究發(fā)現(xiàn)中國肉桂和肉桂皮精油對4 種致病菌（大腸桿菌、單核增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌）表現(xiàn)出加和的抗菌作用；劉曉麗等[45]研究丁香、肉桂及黑胡椒精油單獨和復配后對單核增生性李斯特菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)單一精油的最低抑菌濃度分別為96、72、48 mg/L，復合精油最低抑菌濃度為16 mg/L，說明不同精油之間有協(xié)同作用，可以增強抑菌效果。通過前人的研究也充分說明精油之間的相互作用對一些細菌、真菌性微生物相比于單種精油作用具有較優(yōu)的抑菌效果，混料設計數(shù)學模型適用于不同種精油組合對受試菌株產(chǎn)生較優(yōu)的抑菌效果。

2.3.3 混合優(yōu)化模型分析

圖4 3 種混合植物精油對4 種果蔬真菌最佳抑菌區(qū)域Fig.4 The best antibacterial area of three kinds of mixed plant essential oils against four fruit and vegetable fungi

由圖4響應優(yōu)化分析可知，3 種混合精油對4 種果蔬真菌擬合數(shù)據(jù)MIC均不大于（0.062 5f0.010 0）μL/mL，其復合合意性大于95.0%，且相對抑菌濃度最?。划? 種混合精油（孜然精油、花椒精油、芥子精油）混料比例分別為36.11%、19.45%、44.44%時滿足4 種菌株最佳抑菌反應期望（圖5），對4 種果蔬真菌（粉紅單端孢、擴展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌）預測的最佳MIC分別為0.059 50、0.031 56、0.068 69、0.043 82 μL/mL（MIC＜＜0.125 μL/mL）；其合意性分別為93.97%、99.93%、92.01%、97.32%；總體復合合意性達到95.76%，具有顯著的期望值。分析得出當3 種精油在較佳比例混合作用4 種菌株時，預測的MIC相對于單種精油作用符合最佳抑菌濃度要求，且對4 種菌株具有相對廣譜性的抑菌效果（圖4）。

圖5 3 種混合植物精油對4 種果蔬真菌的最佳混料組合Fig.5 Optimum blend ratio of three essential oils against four fungi in fruits and vegetables

2.4 混合優(yōu)化精油體外抑菌效果實驗分析

通過混合優(yōu)化后的3 種精油（孜然精油、花椒精油、芥子精油）最佳混料比例分別為36.11%、19.45%、44.44%時對4 種果蔬真菌進行體外實驗，根據(jù)1.3.2.3節(jié)操作方法，混合精油處理后的粉紅單端孢、擴展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌菌落直徑分別是未用精油處理的77.15%、32.14%、18.54%、16.9%（圖2）；相比孜然、花椒精油單獨作用具有較強的抗菌效果，但略弱于芥子精油單獨處理的抑菌效果，這可能是芥子精油的主要成分異硫氰基化合物含量多且單一性強所致；從組間對比也得出3 種精油混合作用時，對4 種菌株具有較強的協(xié)同抑菌效果，其對混合后精油敏感強度大小依次是硫色鐮刀菌、互隔交鏈孢、擴展青霉、粉紅單端孢。這也充分證明混合精油相對較低濃度下對菌株具有較優(yōu)的抑菌效果。

3 結(jié) 論

混合植物精油相比于單種植物精油在較低濃度下具有較強的抗菌效果。根據(jù)混料設計分析得出，組合精油的抑菌功效取決于不同精油的成分與混料比以及受試菌株；在孜然、花椒、芥子混料比例分別為36.11%、19.45%、44.44%時，預測對4 種果蔬真菌具有最佳的抑菌效果，瓊脂紙片擴散法體外實驗也證明出混合精油相比于單種精油在較小用量下具有較優(yōu)抑菌效果。通過使用混料設計方法，不僅可以減少精油在抑菌防腐上的用量，而且能夠節(jié)約成本，為配制新型天然食品防腐劑提供了理論依據(jù)。