孫鳳環(huán)， 陳 健 綜述， 張 鵬 審校

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092; 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院胸外科，上海 200433)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤已經(jīng)進(jìn)入了個(gè)體化治療階段。腫瘤的基因組轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳特征在探究腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸和個(gè)體化治療中起到了重要作用。諸多研究[1-7]表明腫瘤微環(huán)境在此過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用，各種檢查點(diǎn)抑制劑的使用顯著提高了部分患者的生存[8]。利用單細(xì)胞測(cè)序可以解析各種腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞的特點(diǎn)，更精準(zhǔn)地從分子層面闡釋腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥的機(jī)制，提高腫瘤的診斷效率、預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)歸并提高個(gè)體化治療水平。本文將對(duì)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及近年來(lái)利用該技術(shù)探究腫瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境特征和耐藥性等各方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

單細(xì)胞測(cè)序(single-cell sequencing, SCS)是從單細(xì)胞水平揭示細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀遺傳變化的技術(shù)，從不同角度揭示細(xì)胞在不同階段的功能和特性，可以通過(guò)一次建庫(kù)，測(cè)得數(shù)百上千個(gè)單細(xì)胞的信息。傳統(tǒng)的測(cè)序方法是對(duì)大量的混合細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，把大量混合細(xì)胞的遺傳信息進(jìn)行平均化，忽略了各種類型的細(xì)胞之間的區(qū)別。如MAP等通過(guò)全部外顯子測(cè)序檢測(cè)了原發(fā)性肺癌的4個(gè)不同區(qū)域的病灶，發(fā)現(xiàn)在不同肺葉的肺癌組織、同一肺葉的不同病灶的肺癌組織、同一肺葉同一病灶不同區(qū)域的肺癌組織的基因表達(dá)差異[9]。但該研究未能明確這些差異表達(dá)基因的細(xì)胞來(lái)源，很有可能忽略一些數(shù)量稀少細(xì)胞的表達(dá)特征。而SCS技術(shù)可以更明確細(xì)胞水平的異質(zhì)性，有利于分析組織中數(shù)量較少細(xì)胞的遺傳信息和異質(zhì)性較大腫瘤的特征。

1.1 SCS的實(shí)現(xiàn)方法

實(shí)現(xiàn)SCS有2種方法： (1) 分離單個(gè)細(xì)胞并獨(dú)立構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序；(2) 給每個(gè)細(xì)胞加上獨(dú)一無(wú)二的DNA序列，測(cè)序時(shí)，把攜帶相同標(biāo)記序列(barcode)的片段視為來(lái)自同一個(gè)細(xì)胞，通過(guò)一次建庫(kù)測(cè)得數(shù)百上千個(gè)單細(xì)胞的信息，見圖1。DNA主要是通過(guò)一種經(jīng)過(guò)改造的高效轉(zhuǎn)座酶(transposase)Tn5來(lái)添加標(biāo)記序列；mRNA只需要在poly T引物的5’端加入標(biāo)記序列即可。為了一次能夠捕獲更多單細(xì)胞，目前最常用的解決方案是組合索引，即通過(guò)Tn5轉(zhuǎn)座和PCR加2次標(biāo)簽[10-11]。

圖1 單細(xì)胞測(cè)序的發(fā)生過(guò)程Fig.1 The process of single cell sequencingA： 箭頭代表移動(dòng)方向,整個(gè)反應(yīng)體系包含： 細(xì)胞、磁珠、細(xì)胞裂解液、反應(yīng)需要的酶、buffer及進(jìn)行油包水的油滴。B： 黑色部分代表細(xì)胞標(biāo)記序列，每個(gè)磁珠只有一種細(xì)胞標(biāo)記序列,黃色部分代表獨(dú)立分子標(biāo)簽(unique molecular indexing, UMI)，每個(gè)鏈上的UMI均不同，橘黃色部分代表來(lái)自細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)

1.2 SCS技術(shù)種類

SCS主要包括單細(xì)胞基因組測(cè)序、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞表觀遺傳測(cè)序，從不同角度揭示了腫瘤微環(huán)境中不同細(xì)胞的特性。

1.2.1 單細(xì)胞基因組測(cè)序 單細(xì)胞基因組測(cè)序主要包括單細(xì)胞全基因組測(cè)序和單細(xì)胞全部外顯子測(cè)序。主要用于鑒定單核苷酸變異、拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNV)和染色體結(jié)構(gòu)變異。

1.2.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 最常用的方法為單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)單細(xì)胞中mRNA進(jìn)行基因表達(dá)定量、功能富集、代謝通路分析。

1.2.3 單細(xì)胞表觀遺傳測(cè)序 單細(xì)胞表觀遺傳測(cè)序主要是研究DNA的表觀遺傳修飾，如甲基化、羥基化以及組蛋白修飾等。目前最為常用的是單細(xì)胞甲基化測(cè)序(single cell methylation sequencing, scM-seq)。scM-seq主要有3種方法： 單細(xì)胞限制性代表區(qū)域甲基化測(cè)序(methylation sequencing of single cell restricted representation regions, scRRBS-seq)、單細(xì)胞亞硫酸氫鹽測(cè)序(single-cell bisulfite sequencing, scBS-seq)、單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)(single-cell whole genome bisulfite sequencing, scWGBS-seq)。其中scBS-seq覆蓋的GpG位點(diǎn)最多，約370萬(wàn)個(gè)。

1.2.4 多組學(xué)測(cè)序 同時(shí)進(jìn)行單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法主要有3種： (1) scGT-seq(single-cell genome and transcriptome codetection and sequencing)： 采用微流體的方式將兩者分離進(jìn)行測(cè)序；(2) G&T-seq(genome and transcriptome sequencing)： 采用物理方法將兩者分離測(cè)序；(3) DR-seq(gDNA-mRNA seque-ncing)： 采用擬線性擴(kuò)增法[12]。

同時(shí)進(jìn)行三重組學(xué)的測(cè)序： 單細(xì)胞三重組學(xué)測(cè)序(single-cell triple omics sequencing, scTrio-seq)可同時(shí)檢測(cè)同一個(gè)單細(xì)胞內(nèi)的基因組、轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組的信息。這種方法是采用一種溫和的裂解方案，僅裂解單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)從而將mRNA釋放到溶液中，同時(shí)保持細(xì)胞核完整。再將裂解產(chǎn)物離心分離含有mRNA的上清液與含有核的沉淀，并將各自轉(zhuǎn)移到不同的管中。對(duì)上清液進(jìn)行scRNA-seq，然后再用scRRBS-seq方法對(duì)沉淀物進(jìn)行DNA甲基化測(cè)序。從而可以同時(shí)得到來(lái)自同一細(xì)胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化的信息[13]。

1.3 單細(xì)胞測(cè)序的流程

單細(xì)胞測(cè)序主要涉及四大步驟，包括單細(xì)胞分離、核苷酸序列(DNA或RNA)擴(kuò)增、基因測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。

1.3.1 單細(xì)胞的分離 實(shí)體腫瘤組織單細(xì)胞分離主要通過(guò)酶解法或機(jī)械法獲取單細(xì)胞懸液，再?gòu)钠渲蟹诌x出合適的細(xì)胞群進(jìn)行后續(xù)操作；循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以直接進(jìn)行分選，分選方法包括通過(guò)表面標(biāo)記/表型分離的方法(流式細(xì)胞術(shù)、微流控、顯微操作、光鑷和激光捕獲顯微切割)[14-15]和稀有細(xì)胞群的獲取方法(nanofilters，MagSweeper，激光捕獲，Cell Search，DEP陣列和CellCelector)[16]。

1.3.2 核苷酸序列擴(kuò)增 人類二倍體單細(xì)胞中DNA重量?jī)H為6pg，遠(yuǎn)低于NGS所需的ng～μg DNA量,因此進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序時(shí)需要高效準(zhǔn)確的DNA擴(kuò)增。DNA擴(kuò)增的方法主要有： (1) PCR技術(shù)[引物延伸預(yù)擴(kuò)增PCR(PEP-PCR)、簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、變體置換DOP-PCR(D-DOPPCR)]；(2) 多重置換擴(kuò)增技術(shù)；(3) 微孔置換擴(kuò)增系統(tǒng);(4) 多重退火和基于循環(huán)的擴(kuò)增循環(huán)[14,17-19]。同時(shí)，單細(xì)胞中含10pg的總RNA和0.1pg的mRNA,需要將mRNA高保真性高效地反轉(zhuǎn)錄為cDNA雙鏈，再進(jìn)行擴(kuò)增。轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增的方法包括： (1) smart-seq(Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)或smart-seq2；(2) Phi29轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增；(3) 基于PCR的半隨機(jī)轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增；(4) UMI[12]。

1.3.3 建庫(kù)測(cè)序 基因測(cè)序是通過(guò)構(gòu)建文庫(kù)，利用各種測(cè)序方法，分析基因或轉(zhuǎn)錄組堿基序列、基因的表觀遺傳修飾。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析是指通過(guò)各種算法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行搜索(收集和篩選)，處理(編輯、整理、管理和顯示)及利用(計(jì)算、模擬)，從測(cè)序結(jié)果中獲取有用信息的一種方法。

2 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用

2.1 揭示腫瘤發(fā)展過(guò)程中單細(xì)胞基因變異

Kim等[20]從2個(gè)肺腺癌患者來(lái)源的腫瘤細(xì)胞異種植入的小鼠(PDX)中提取了83個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,對(duì)其中43個(gè)小鼠的重復(fù)樣本進(jìn)行全外顯子測(cè)序，觀察到包括KRASG12D在內(nèi)的50種腫瘤特異性單核苷酸變異，發(fā)現(xiàn)了所有的PDX細(xì)胞之間均具有異質(zhì)性[20]。

Ni等[21]通過(guò)對(duì)一種肺癌亞型(不包括其它亞型)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)個(gè)體(甚至不同)患者的CTC中一些高度重現(xiàn)的CNV與耐藥相關(guān)，一些基因位點(diǎn)(如c-Myc，TERT，HLA)的特定組合的CNV與轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能的機(jī)制是： 原發(fā)性腫瘤中的癌細(xì)胞與某些CNV可以侵入周圍組織并有效浸潤(rùn)，這也可能使CTC發(fā)生免疫逃逸。這些為腫瘤的無(wú)創(chuàng)診斷和個(gè)體化治療提供了新思路。

2.2 發(fā)現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性

腫瘤的異質(zhì)性是腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中細(xì)胞遺傳物質(zhì)在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的不同層面發(fā)生變化，導(dǎo)致子代細(xì)胞在基因型和表型中均存在差異。腫瘤的異質(zhì)性主要體現(xiàn)在4個(gè)層面： 不同腫瘤之間、同一腫瘤的不同病灶之間、同一個(gè)腫瘤的同一個(gè)病灶的不同區(qū)域、同一腫瘤的同一病灶的同一區(qū)域的不同細(xì)胞之間。Kim等[22]用腎切除術(shù)后1年內(nèi)出現(xiàn)獨(dú)立肺轉(zhuǎn)移灶的透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌患者的肺轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，以及原發(fā)的及肺轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞異種植入的小鼠的116個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序,在單細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)了腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)頑固性患者體內(nèi)有不同的靶向藥物通路活化，制定了靶向轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞中的兩個(gè)相互獨(dú)立的通路的治療戰(zhàn)略。Hou等[23]從1例患者的骨髓樣本中隨機(jī)選取了82個(gè)骨髓細(xì)胞以及8個(gè)正常口腔黏膜上皮細(xì)胞，進(jìn)行了單細(xì)胞全部外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)骨髓增殖性腫瘤患者的腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜完全不同，不同腫瘤細(xì)胞之間的基因表達(dá)也存在差異，呈現(xiàn)遺傳多樣性。發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞同時(shí)存在多種基因突變的短暫時(shí)期，其中有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞群發(fā)展成為腫瘤。

2.3 探究腫瘤各亞型之間的基因序列差異

Venteicher等[24]對(duì)10例IDH-A腫瘤患者的9879 個(gè)單細(xì)胞和6個(gè)IDH-O腫瘤的4347個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與165個(gè)TCGA的數(shù)據(jù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在IDH-A和IDH-O中觀察到有相同的膠質(zhì)譜系和發(fā)育層次結(jié)構(gòu)，表明所有IDH突變膠質(zhì)瘤起源于同一個(gè)祖細(xì)胞。與神經(jīng)膠質(zhì)譜系的相似性相反，IDH-A和IDH-O在其腫瘤微環(huán)境中差異顯著，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的富集程度。小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在不同臨床分期的IDH-A腫瘤之間也不同。這一研究成果對(duì)于此類疾病的管理和治療具有重要意義。Casasent等[25]從10例乳腺導(dǎo)管原位癌和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的腫瘤組織中分離了1293個(gè)細(xì)胞，并對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌與導(dǎo)管原位癌原位癌之間有直接的基因相關(guān)性(有相同的突變和CNAs)，來(lái)自同一個(gè)譜系，在發(fā)生浸潤(rùn)性改變之前就已經(jīng)發(fā)生浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的基因突變和復(fù)制子變化，一個(gè)或多個(gè)克隆遷移到周圍組織形成了浸潤(rùn)性腫瘤。

2.4 區(qū)分腫瘤中的免疫細(xì)胞亞群

Zheng等[26]從6例肝細(xì)胞癌患者的外周血、腫瘤組織、腫瘤鄰近部位正常組織中分離了5063個(gè)T細(xì)胞，進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞亞群分類、發(fā)展軌跡分析，比較了不同亞群中T細(xì)胞克隆的分布，探討了不同亞群之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了每個(gè)亞群的特異性基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相較于外周血和癌旁組織的T細(xì)胞，腫瘤組織中大量存在CD8+T細(xì)胞的功能紊亂及抑制性T細(xì)胞。并證明Layilin基因?qū)τ贑D8+T細(xì)胞的殺傷功能有抑制作用，可能會(huì)成為免疫療法的新靶點(diǎn)。同時(shí)，基于TCR數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，肝癌內(nèi)存在大量處于耗竭狀態(tài)的T細(xì)胞，揭示了腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的原因。此外，該研究還描繪了初始T細(xì)胞向耗竭狀態(tài)的發(fā)展軌跡，并在耗竭性CD8+T細(xì)胞亞群中發(fā)現(xiàn)了一類FOXP3+抑制性T細(xì)胞的存在，提出了耗竭的CD8+T細(xì)胞可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成抑制性T細(xì)胞。

2.5 探索腫瘤的發(fā)生過(guò)程

Tanga等[13]運(yùn)用最新的scTrio-seq技術(shù)對(duì)1例肝癌患者癌組織中的25個(gè)癌細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行了3種組學(xué)的分析。發(fā)現(xiàn)這25個(gè)肝癌細(xì)胞來(lái)自2個(gè)不同的細(xì)胞亞群。在基因組水平上，亞群I中的細(xì)胞含有較多拷貝數(shù)增加的染色體及染色體片段，而亞群II中含有較多拷貝數(shù)減少的染色體和染色體片段；在DNA甲基化水平上，亞群I比亞群II有更高的DNA甲基化水平，且產(chǎn)生的差異大多發(fā)生在CpG島(CGI)區(qū)域；在轉(zhuǎn)錄組水平上，多個(gè)與炎癥免疫應(yīng)答相關(guān)的基因，以及與補(bǔ)體激活相關(guān)的基因表達(dá)在亞群I中都明顯降低，而與癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要基因ANO1和S100A11等的表達(dá)在2個(gè)亞群中也有明顯差別。對(duì)于多種組學(xué)數(shù)據(jù)的分析顯示，在被檢測(cè)肝癌細(xì)胞中，數(shù)量上占比較小的亞群I的細(xì)胞的DNA拷貝數(shù)變異更多，且DNA甲基化水平更高，可能更易逃脫患者免疫系統(tǒng)的識(shí)別，更易出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

2.6 闡釋腫瘤的耐藥機(jī)制

Miyamoto等[27]從13例雄激素抵抗(AR)的患者體內(nèi)收集77份CTC進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)將AR患者CTC與未進(jìn)行治療患者的CTC進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)AR組Wnt信號(hào)通路激活。從而闡釋了前列腺癌細(xì)胞對(duì)雄激素剝奪療法抵抗的原因。Kim等[20]從2例肺腺癌患者來(lái)源的腫瘤細(xì)胞異種植入的小鼠(PDX)中提取了83個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,對(duì)其中43個(gè)小鼠的重復(fù)樣本進(jìn)行全外顯子測(cè)序，觀察到包括KRASG12D在內(nèi)的50種腫瘤特異性單核苷酸變異，發(fā)現(xiàn)了所有的PDX細(xì)胞之間均具有異質(zhì)性。作者根據(jù)KRASG12D突變和69個(gè)肺腺癌預(yù)后基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將PDX細(xì)胞分為4組，發(fā)現(xiàn)表達(dá)KRASG12D和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的組的PDX細(xì)胞在體外抗癌藥物治療后依舊存活,說(shuō)明表達(dá)KRASG12D和高RS的PDX細(xì)胞可能與耐藥相關(guān)。此外，高表達(dá)KRASG12D和高RS的PDX細(xì)胞會(huì)掩蓋無(wú)KRASG12D(KRASWT)和/或低RS細(xì)胞類型。具有不同作用機(jī)制(細(xì)胞毒性和靶向特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)的殺腫瘤抗癌藥物能將高表達(dá)KRASG12D和高RS的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅磉_(dá)KRASG12D和低RS的PDX細(xì)胞。從而說(shuō)明： (1)具有激活的KRAS標(biāo)簽的腫瘤細(xì)胞是藥物靶標(biāo)，但KRAS突變本身不是靶標(biāo);(2)與耐藥性相關(guān)的腫瘤群體可能被群體內(nèi)的顯性基因組特征的群體掩蓋。(3)參與離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)的基因和P型ATP酶的上調(diào)可能在耐藥性中起關(guān)鍵作用。

3 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的局限性

盡管運(yùn)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移已經(jīng)有了一定的成果，但無(wú)論是單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)本身還是在腫瘤研究中的應(yīng)用都有一些問(wèn)題尚待解決。(1) 覆蓋率低。(2) 缺乏一定的空間信息。單細(xì)胞測(cè)序在單細(xì)胞分離過(guò)程中將單個(gè)細(xì)胞從組織中分離出來(lái)，整個(gè)測(cè)序過(guò)程不能還原其本身的結(jié)構(gòu)，尚且需要結(jié)合免疫組化等其他方法進(jìn)行空間定位。(3) 缺乏從循環(huán)腫瘤細(xì)胞中獲取更高純度的腫瘤干細(xì)胞的方法[28]。(4) 對(duì)于實(shí)現(xiàn)DNA高效率高保真度擴(kuò)增的方法以及實(shí)現(xiàn)mRNA反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)化為高效率高保真度的DNA雙鏈的方法的研究仍需繼續(xù)深入。(5) 仍需探索捕獲更多GPG位點(diǎn)的方法。

目前大多數(shù)針對(duì)腫瘤的研究尚且聚焦于單細(xì)胞基因組水平，轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和表觀遺傳的研究尚且不多。不能完整的揭示整個(gè)腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程。

4 展 望

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能鑒別腫瘤發(fā)展過(guò)程中的基因變異及其變異率、腫瘤的異質(zhì)性、追溯關(guān)鍵基因的克隆起源、腫瘤各亞型之間的基因序列差異，區(qū)分腫瘤中的免疫細(xì)胞亞群、探索腫瘤微環(huán)境，探索腫瘤的發(fā)生過(guò)程，闡釋腫瘤的耐藥機(jī)制，提高腫瘤的治療效果。雖然單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)尚存在一些局限性，但它為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了新技術(shù)，有望在腫瘤的早期診斷、病程進(jìn)展和治療的方面提供新的預(yù)防和治療手段?？梢詫渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于肺癌領(lǐng)域，從基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳3個(gè)方面鑒別肺癌發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的原因，不同類型肺癌的預(yù)后不同的原因，不同患者對(duì)放化療和藥物治療反應(yīng)性不同的原因，并尋找這些事件發(fā)生的標(biāo)志物，以該標(biāo)志物為指導(dǎo)進(jìn)行疾病的預(yù)防、診斷、手術(shù)方式以及是否進(jìn)行新輔助化療，術(shù)后放化療和藥物輔助治療方式的選擇，并可以以此為靶點(diǎn)研究新的治療藥物和方法。