劉燦珍，侯冬冬，劉 文，孫玉霞，秦偉帥，趙新節(jié)*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué) 山東省微生物工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250353；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南250100；3.泰山學(xué)院 生物與釀酒工程學(xué)院，山東 泰安271000）

海棠果果實(shí)偏小，甜味中稍帶酸味和澀味，含有豐富的有機(jī)酸、微量元素、維生素、多酚復(fù)合物等，黃酮類物質(zhì)是多酚復(fù)合物中的主要成分，具有很高的抗氧化活性[1]。在氧化條件下，脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)會受到破壞，而酚類物質(zhì)可阻擋自由基，破壞自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，調(diào)節(jié)生物體生理功能[2-3]，但因海棠果的品種及生長環(huán)境不同，酚類物質(zhì)的含量也不同[4]。

果實(shí)發(fā)酵酒的化學(xué)成分與揮發(fā)性成分不僅來源于果實(shí)本身，還包括酵母菌的代謝[5]。酵母在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的發(fā)酵副產(chǎn)物，包括高級醇、脂肪酸、乙酸酯、乙基酯、醛、有機(jī)酸等，是發(fā)酵酒的重要香氣成分并顯著影響發(fā)酵酒的感官和品質(zhì)[6]。酵母菌對芳香族化合物和果香水平的影響占主導(dǎo)地位，不同的酵母菌種發(fā)酵同種葡萄汁產(chǎn)生的香氣成分明顯不同，這是由于酵母的代謝活性、合成酶和分解酶活性不同，導(dǎo)致釋放和合成多種揮發(fā)性復(fù)合物的能力不同[7-8]。目前對海棠果的研究有海棠果果實(shí)營養(yǎng)物質(zhì)方面，包括對海棠果的果皮、果肉、種子的酚類物質(zhì)進(jìn)行探究[9]，以及在產(chǎn)品開發(fā)方面，將海棠果加工為果條、果醬等[4]。在發(fā)酵海棠果果酒方面以及利用不同釀酒酵母發(fā)酵海棠果酒方面還需要進(jìn)一步研究，因此，通過對不同釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵海棠果果酒的活性成分及香氣物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，并篩選出適合釀造海棠果果酒的釀酒酵母具有重要意義。

本研究利用5株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）RC212、TOP15、71B、DV10、CY3079分別發(fā)酵海棠果制備海棠果酒，對5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒的基本理化指標(biāo)、生物活性成分的含量及揮發(fā)性香氣成分的種類與含量進(jìn)行分析，以便于選擇適合發(fā)酵海棠果果酒的釀酒酵母，為海棠果發(fā)酵酒的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

垂絲海棠果（總糖135 g/L、還原糖112.5 g/L、總酸15.45 g/L、pH值3.74、可溶性固形物16%）：臨沂市河?xùn)|區(qū)。

ROHAVIN果膠酶（50 000 U/g）：上海鼎唐國際貿(mào)易有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）RC212、TOP15、71B、DV10、CY3079：上海杰兔工貿(mào)有限公司；沒食子酸、兒茶素、香草醛、蘆丁（純度均≥98%）、福林酚（1 mol/L）：索萊寶生物有限公司；偏重亞硫酸鉀、菲林試劑（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPL-250生化培養(yǎng)箱：天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；DLSB-5L/25低溫冷卻液循環(huán)泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TQ8050自動固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、7890B氣相色譜-5977A型質(zhì)譜（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 海棠果酒的制備工藝及操作要點(diǎn)

海棠果→果粒分選→破碎打漿→調(diào)整硫含量→添加果膠酶→調(diào)整糖含量→分別接種5株釀酒酵母→發(fā)酵（22 ℃）→發(fā)酵結(jié)束→皮渣分離→添加偏重亞硫酸鉀，調(diào)整硫含量→低溫澄清→海棠果酒

操作要點(diǎn)：

（1）偏重亞硫酸鉀添加量均為120 mg/L，果膠酶添加量為50 mg/L，總糖含量為210 g/L，酵母添加量為300 mg/L。

（2）酵母活化：按酵母與水的質(zhì)量體積比為1∶10將酵母接種于含有5%的糖水中，37 ℃溫和攪拌活化30 min，再逐漸添加海棠果汁溫和攪拌活化15 min。

（3）發(fā)酵過程中每天進(jìn)行攪拌。

分別在發(fā)酵第1、3、5、7、10、13、18天取樣、離心。

1.3.2 海棠果酒基本理化指標(biāo)分析

殘?zhí)恰H值、總酸、揮發(fā)酸、酒精度的測定參照國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；還原糖的測定采用斐林試劑法。

1.3.3 海棠果酒活性成分分析

總酚含量測定采用福林酚法[10]；單寧含量測定采用鹽酸-香草醛法[11]；總黃酮含量測定采用分光光度法[12]。

1.3.4 海棠果酒香氣成分分析

固相微萃?。喝“l(fā)酵結(jié)束后的海棠果酒8 mL于20 mL頂空瓶中，同時加入2 g NaCl及20 μL質(zhì)量濃度為2 g/L的內(nèi)標(biāo)4-甲基-2-戊醇。升溫到45 ℃時，用DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取50 min，解吸10 min，進(jìn)樣分析。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25 mm×0.25 μm）。梯度升溫程序?yàn)槌跏贾?0 ℃，保持2 min；1 ℃/min升溫至45 ℃，保持2 min；3 ℃/min升溫至84 ℃，保持2 min；3 ℃/min升溫至120 ℃，保持3 min；3 ℃升溫至200 ℃；5 ℃升溫至230 ℃。載氣為氦氣（He）；流速為1.221 mL/min，不分流。

質(zhì)譜條件：離子源為電子電離（electron ionization，EI）源；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為30～400 m/z[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 株釀酒酵母對海棠果酒基本理化指標(biāo)的影響

5株釀酒酵母發(fā)酵海棠果結(jié)束后，海棠果酒的基本理化指標(biāo)見表1。

表1 5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒的理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indexes of crab apple wines fermented by 5 strains of Saccharomyces cerevisiae

由表1可知，在5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中，殘?zhí)橇烤?0 g/L，酒精度均＞10%vol。其中，酵母菌CY3079發(fā)酵的海棠果酒的殘?zhí)橇浚?4.20 g/L）最低，酒精度（13.00%vol）最高，其次是酵母菌DV10。5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒的殘?zhí)橇烤?0 g/L的原因可能是在發(fā)酵中未補(bǔ)充可同化氮源，限制了氮源代謝，使酵母生長繁殖需要的蛋白合成前體物合成受阻，從而使發(fā)酵終止[14]；也可能是果膠酶分解果膠等物質(zhì)產(chǎn)生酵母難以利用的還原糖，從而使殘?zhí)橇枯^高[16]。海棠果酒較海棠果汁本身的pH值（3.74）均升高，除酵母菌TOP15與DV10外，總酸含量均高于原料海棠果（15.45 g/L），說明酵母菌TOP15與DV10具有一定降酸能力，但發(fā)酵后的總酸含量均＞14.0 g/L，超出國標(biāo)GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求（8.0 g/L）[15]，因此，在釀造過程中需要進(jìn)行降酸處理。另外，揮發(fā)酸物質(zhì)含量（0.23～0.56 g/L）均＜1.2 g/L，符合果酒相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[15]。

2.2 5株釀酒酵母對海棠果酒生物活性成分的影響

5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中還原糖含量變化趨勢如圖1所示。

圖1 5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中還原糖含量變化趨勢Fig. 1 Change trend of reducing sugar content in crab apple wines fermented by 5 strains of Saccharomyces cerevisiae

由圖1可知，除酵母菌RC212與TOP15外，其余3株釀酒酵母在發(fā)酵過程中，海棠果酒中還原糖含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這是由于在發(fā)酵前期，酵母菌將不能利用的非還原性物質(zhì)（果膠等）轉(zhuǎn)化為還原糖，使前3天發(fā)酵液中的還原糖含量升高；隨后酵母菌利用還原糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，因此還原糖含量下降[16]，且在發(fā)酵5～7 d間的還原糖消耗量最大，均＞100 g/L，發(fā)酵速率最快；發(fā)酵10 d后，還原糖含量基本保持不變，其中酵母菌RC212發(fā)酵速率最快，除TOP15酵母外，其余釀酒酵母菌均具有良好的發(fā)酵性能。

5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中生物活性成分含量測定結(jié)果見表2。

表2 5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中生物活性成分含量Table 2 Bioactive components contents in crab apple wines fermented by 5 strains of Saccharomyces cerevisiae

由表2可知，酵母菌71B、RC212發(fā)酵的海棠果酒中總酚含量相對其他3株酵母菌較高，分別為1.67 g/L、1.62 g/L，其他酵母菌發(fā)酵的海棠果酒中總酚含量在1.35～1.47 g/L。同時，酵母菌71B與RC212發(fā)酵的海棠果酒中單寧含量也相對較高，分別為0.78 g/L、0.71 g/L。酵母菌RC212發(fā)酵的海棠果酒中黃酮含量最高，酵母菌CY3079次之?？傮w來說，酵母菌71B與RC212發(fā)酵的海棠果酒中生物活性成分含量較高，酵母菌TOP15與DV10發(fā)酵的海棠果酒中生物活性成分含量較低。除酒精度影響酚類物質(zhì)含量外，發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞壁吸附酚類物質(zhì)[17]、單寧與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)結(jié)合成不溶性的沉淀[18]、酵母的次級代謝物丙酮酸、乙醛等與多酚類物質(zhì)反應(yīng)生成大分子聚合物、微生物產(chǎn)生的酶降解多酚類物質(zhì)導(dǎo)致其水溶性下降產(chǎn)生沉淀[19]等均會對酚類物質(zhì)的含量產(chǎn)生影響。

2.3 5 株釀酒酵母發(fā)酵海棠果酒香氣成分分析

5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中香氣成分的種類和含量測定結(jié)果見表3。

表3 5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中香氣成分的種類及含量Table 3 Types and contents of aroma components in crab apple wines fermented by 5 strains of Saccharomyces cerevisiae

續(xù)表

續(xù)表

由表3可知，通過GC-MS從5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中共檢測到62種揮發(fā)性物質(zhì)，包括29種酯類、13種醇類、8種酸類、5種醛酮類、5種萜烯類和2種其他類物質(zhì)。酵母菌71B發(fā)酵的海棠果酒中揮發(fā)性物質(zhì)總含量最高，為267.02mg/L，其次為酵母菌RC212（228.56 mg/L），酵母菌CY3079發(fā)酵的海棠果酒中揮發(fā)性物質(zhì)的總含量為177.20 mg/L，稍低于酵母菌DV10（191.01 mg/L），酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒中揮發(fā)性物質(zhì)的總含量最低，為102.90 mg/L。

2.3.1 酯類物質(zhì)

5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中酯類物質(zhì)的總含量存在明顯差異（P＜0.05），其中酵母菌RC212發(fā)酵的海棠果酒中酯類物質(zhì)含量最高，為114.43 mg/L。其次為酵母菌71B與CY3079，分別為78.26 mg/L、77.91 mg/L，海棠果酒中酯類含量相近。酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒中酯類物質(zhì)含量為68.07 mg/L。酵母菌DV10發(fā)酵的海棠果酒中酯類物質(zhì)含量最低，為54.02 mg/L。

酵母菌RC212與酵母菌71B發(fā)酵的海棠果酒中均檢測到23種酯類物質(zhì)，酵母菌CY3079與TOP15發(fā)酵的海棠果酒中均檢測到22種酯類物質(zhì)，但酵母菌DV10發(fā)酵的海棠果酒中的酯種類最少（17種）。5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中共檢測到6種乙酸酯，乙酸酯中乙酸乙酯的含量均＜100 mg/L，其中酵母菌RC212最高，賦予海棠果酒愉人的果香氣味。乙酸異戊酯為海棠果酒提供香蕉香氣，5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中乙酸異戊酯含量均＞其閾值（0.2 mg/L）[13]，且在酵母菌RC212發(fā)酵的海棠果酒中含量較高，為22.19 mg/L，是其他4種釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒的10倍。海棠果酒中還檢測到8種乙基酯，其中己酸乙酯（香蕉、菠蘿、蘋果香氣）、辛酸乙酯（玫瑰、橙子香氣）、癸酸乙酯（果香、花香）、月桂酸乙酯（月桂油香氣）是發(fā)酵酒中的主要乙基酯類物質(zhì)[13]。酵母菌RC212發(fā)酵的海棠果酒在上述4種乙基酯中的含量均最高。丁二酸二乙酯提供果香及瓜香[20]，在酵母菌CY3079發(fā)酵的海棠果酒中含量最高，為0.52 mg/L，但在酵母菌DV10發(fā)酵的海棠果酒中未檢測到。乙酸異丁酯、甲酸乙酯、正辛酸異丁酯僅在酵母菌RC212發(fā)酵的海棠果酒中檢測到，甲酸辛酯、苯甲酸甲酯僅在酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒中檢測到，4-羥基丁酸內(nèi)酯僅在酵母菌71B發(fā)酵的海棠果酒中檢測到。

2.3.2 醇類物質(zhì)

5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中共檢測出13種醇類物質(zhì)，其中多數(shù)屬于高級醇。

酵母菌71B發(fā)酵的海棠果酒中總醇含量最高，為167.89 mg/L，酵母菌CY3079與DV10發(fā)酵的海棠果酒中總醇含量次之，分別為152.78mg/L、157.37mg/L，酵母菌RC212發(fā)酵的海棠果酒中總醇含量為94.45 mg/L，酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒中總醇含量最低，為78.89 mg/L。5種釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中高級醇總量均＜400 mg/L，可增加發(fā)酵酒香氣的復(fù)雜性。異丁醇（溶劑、酒精、生青味）、異戊醇（果香、指甲油氣味）、己醇（生青味）、苯乙醇（茉莉、玫瑰花香）是發(fā)酵酒中主要的醇類物質(zhì)[13]，其中異戊醇是海棠果酒中含量最高的醇類物質(zhì)，均＞其閾值（14.5 mg/L），除酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒外，其余4株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中異戊醇含量均占高級醇總量的61%以上，酵母菌71B發(fā)酵的海棠果酒中異戊醇含量最高，為103.91 mg/L，是酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒中異戊醇含量（43.59 mg/L）的2.3倍，是酵母菌CY3079（88.37 mg/L）、DV10（86.28 mg/L）

發(fā)酵的海棠果酒的1.2倍。苯乙醇也是高級醇中比重較大的醇，除酵母菌RC212（7.58 mg/L）、TOP15（8.80 mg/L）外，其余3株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中苯乙醇含量均＞其閾值（10.0 mg/L），是閾值的3倍多。5株酵母發(fā)酵酒的己醇含量均＞其閾值（1.1 mg/L），且酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒中己醇含量最高，為8.60 mg/L，酵母菌RC212發(fā)酵的海棠果酒中己醇含量最低，為4.82 mg/L。

2.3.3 酸類物質(zhì)

5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中共檢出8種酸類物質(zhì)，主要包括乙酸（醋酸味）、新癸酸（脂肪香、奶香）、辛酸（腐臭、奶酪、脂肪酸）、苯甲酸（苯味）[22]，均未檢測到己酸。

酵母菌DV10發(fā)酵的海棠果中總酸含量最高，其中乙酸含量也最高，為3.50mg/L，其次為酵母菌CY3079（2.94mg/L），乙酸含量最低的是酵母菌RC212（1.58 mg/L）。酵母菌RC212發(fā)酵的海棠果酒中辛酸、癸酸含量均最高，酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒中苯甲酸含量最高。乙酸是發(fā)酵酒中主要的揮發(fā)酸，可與醇反應(yīng)生成有水果香的醋酸酯，醋酸含量過高時，說明發(fā)酵酒被醋酸菌、乳酸菌污染，超過閾值200 mg/L時，發(fā)酵酒帶有酸味。由于5株酵母發(fā)酵的海棠果酒中酸含量均較低，因此不會給發(fā)酵酒帶來不愉悅的香氣。

2.3.4 其他類

5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中檢出的揮發(fā)性香氣物質(zhì)除酯類、醇類、酸類外，還包括醛酮類、萜烯類、揮發(fā)性酚類物質(zhì)等。乙醛是發(fā)酵酒中主要的羰基化合物，具有青蘋果和堅(jiān)果的香氣，也是葡萄酒氧化的標(biāo)志，當(dāng)紅葡萄酒中乙醛含量＜100 mg/L時，賦予葡萄酒香氣復(fù)雜性，乙醛僅在酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒中檢測到。α-紫羅酮具有覆盆子香氣[13]，在酵母菌RC212發(fā)酵的海棠果酒中的含量最高（0.83 mg/L），是其他3株酵母71B、CY3079、DV10發(fā)酵的海棠果酒的2倍，同時苯甲醛含量（杏仁香氣）也最高。萜烯類物質(zhì)主要來源于果實(shí)本身，其含量在發(fā)酵酒香氣成分中的比重較小，酵母菌DV10發(fā)酵的海棠果酒中萜烯類物質(zhì)含量最高（14.76 mg/L），在檢出的5種萜烯類物質(zhì)中，芳樟醇（鈴蘭香氣）的含量最高，為13.63 mg/L。2,4-二叔丁基苯酚在5株酵母發(fā)酵的海棠果酒中均被檢出，且在酵母菌CY3079發(fā)酵的海棠果酒中的含量最高（11.80 mg/L）。

3 結(jié)論

分別采用5株釀酒酵母發(fā)酵海棠果，獲得5種海棠果酒，對5種海棠果酒的基本理化指標(biāo)、生物活性成分及香氣成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在5株釀酒酵母發(fā)酵的海棠果酒中，除殘?zhí)橇科咄?，其他均達(dá)到發(fā)酵酒的標(biāo)準(zhǔn)。酵母菌71B發(fā)酵的海棠果酒中總酚、單寧含量最高，黃酮含量居中。通過氣質(zhì)（GC-MS）聯(lián)用法共檢測到62種揮發(fā)性物質(zhì)，5種海棠果酒中共有揮發(fā)性物質(zhì)為34種，主要香氣成分包括乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、異丁醇、異戊醇、苯乙醇。不同酵母發(fā)酵的海棠果酒的香氣成分存在差異。酵母菌RC212發(fā)酵酒的酯類物質(zhì)含量最高；酵母菌71B發(fā)酵的海棠果酒中醇類物質(zhì)含量最高；酵母菌DV10發(fā)酵的海棠果酒中酸類、萜烯類物質(zhì)含量最高；酵母菌TOP15發(fā)酵的海棠果酒中醛酮類物質(zhì)含量最高，但醇類物質(zhì)含量最低。本研究為實(shí)踐中發(fā)酵海棠果酒挑選滿足特定需要的酵母提供理論基礎(chǔ)。