韋云妮，楊斌，梁麗莉，張夢師，許藝齡，王柳萍

(1廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧 530021；2廣西中醫(yī)藥大學)

中國最新癌癥數據顯示，肺癌仍是各類癌癥之首，癌癥防治已是人們關注的重點對象[1～3]。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌中的一種主要類型[4]，且由于發(fā)現較晚以及醫(yī)療技術水平的限制，加大了肺癌的醫(yī)治難度和復發(fā)風險[5]。復方夏枯草制劑由夏枯草、淫羊藿等制成。夏枯草味辛，性寒，常用于軟堅散結、消腫、抗腫瘤等[6,7]，其機制主要與腫瘤細胞增殖受到抑制、誘導腫瘤細胞凋亡、誘導分化、抗氧化、免疫調節(jié)、逆轉腫瘤耐藥等因素有關[8]。淫羊藿味甘，性溫和，活性成分活躍，其不僅能阻滯前列腺癌細胞腫瘤生長、侵襲和遷移，還能使黑色素B16腫瘤細胞發(fā)生凋亡[9～11]。本課題組成員在前期實驗發(fā)現，由夏枯草、西紅花、膽南星、龍血竭、冰糖草等組成的依癌膠囊對人非小細胞肺癌NCI-H460細胞裸鼠移植瘤有抑制作用，且不良反應小[12]。除此之外，關于淫羊藿和夏枯草對人肺癌H460細胞的影響，至今仍無詳細的研究報道。2015年11月～2018年3月,本研究觀察了不同濃度復方夏枯草制劑對NCI-H460細胞移植裸鼠瘤體生長的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級裸鼠(BALB/c)36只，雄性，3～5周齡，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限責任公司[許可證號碼：SCXK(湘)2016-0002]。

1.2 藥物、試劑及儀器 復方夏枯草制劑中的中藥材由北海天洄生物技術有限公司提供，本課題組制成復方夏枯草制劑，取處方中的淫羊藿、夏枯草等4味藥材，粉碎成粗粉，加入十倍量水進行煎煮，提取3次，1 h/次，合并3次煎煮液濾過，減壓濃縮至每毫升含2 mg生藥，4 ℃保存?zhèn)溆?；環(huán)磷酰胺(CTX，百特醫(yī)療用品貿易有限公司)?？捡R斯亮蘭試劑盒(南京建成生物工程研究所)。潔凈凈化工作臺(蘇州凈化設備總廠)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，十萬分之一電子天平[梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司]。

1.3 NCI-H460細胞培養(yǎng) 超凈工作臺經紫外照射30 min后將NCI-H460細胞置于含有配好培養(yǎng)液(由RPMI1640培養(yǎng)基、GIBCO血清、雙抗青鏈霉素按90∶10∶1的比例混合而成)的培養(yǎng)瓶中，于細胞房37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，并每天潤洗換液。

1.4 裸鼠移植瘤模型制備、分組及復方夏枯草制劑灌胃 超凈工作臺經紫外照臺30 min后，用0.25的胰蛋白酶消化細胞，按照文獻方法進行操作。在SPF環(huán)境下，碘伏消毒裸鼠右后肢皮膚表面，取醫(yī)院常用的1 mL注射器吸0.2 mL的NCI-H460細胞懸液注射到裸鼠右后肢皮下，注射完畢后用棉簽輕輕按壓30 s，接種完畢后繼續(xù)在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，并在每天固定時間范圍內觀察記錄裸鼠活動、精神、生存及瘤體生長情況。腫瘤體積長到60～80 mm3的30只裸鼠分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性組、模型組各6只，另取6只正常裸鼠作為對照組，高劑量組、中劑量組、低劑量組分別以2.4、1.2、0.6 g/kg的復方夏枯草制劑灌胃，陽性組注射0.025 g/kg的CTX，對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水；陽性組隔兩天給藥1次，其他組每天1次。

1.5 裸鼠一般情況觀察及瘤體積測量和瘤重、藥物抑瘤率計算 在給藥期間，每天固定時間范圍內觀察并記錄已接種細胞的裸鼠生存質量、精神狀態(tài)、行為飲食及腫瘤生長情況。給藥結束次日，在處死裸鼠之前先將裸鼠稱重并用游標卡尺測量移植瘤的近似大小，再用鑷子和小剪刀小心完整剝離取出移植瘤，迅速剔除血塊、脂肪、腫瘤包膜及壞死組織，生理鹽水沖洗，然后拿吸水紙吸去殘余水分，于萬分之電子稱調零之后稱取瘤體的重量，隨后用小剪刀把瘤體分成兩塊，分別放到-80 ℃冰箱里凍存和固定在裝有4多聚甲醛的離心管里，待用。計算腫瘤體積，抑瘤率(IR)=(1-實驗組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%；計算抑瘤率，抑瘤率=(1-復方夏枯草制劑組平均腫瘤體積/模型組平均腫瘤體積)×100%，有標準規(guī)定中藥醫(yī)治腫瘤其抑瘤率>30%被視為有效。

1.6 瘤組織病理形態(tài)學觀察 參照文獻[13]方法，于光學顯微鏡下觀察腫瘤的生長情況和壞死程度等。

1.7 瘤組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3檢測 采用免疫組化法。按照試劑盒說明書的實驗步驟進行操作，將組織切片脫蠟至水修復、孵育，血清封閉，加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木精染色，酒精分化，水洗返藍，中性樹膠封片，鏡檢。結果判斷標準：若被著色為黃色則發(fā)生陽性反應，Bcl-2、Bax、Caspase主要是胞質呈陽性。隨機取5個視野在200倍光鏡下觀察，并計算呈陽性細胞的百分比，取其平均值。

2 結果

2.1 各組裸鼠一般情況比較 與模型組相比，給藥組裸鼠的精神，行為活動、食欲均無明顯異常，瘤體生長緩慢；CTX組形體消瘦，體質量減輕，精神萎靡，瘤體積較模型組小。各組給藥前后瘤體積及腫瘤體積比較見表1。高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組、陽性組抑瘤率分別為43.9%、21.5%、13.0%、0、71.7%。

表1 各組給藥前后瘤體積及瘤重比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.2 各組瘤組織病理形態(tài)比較 各組瘤組織均為細胞核呈藍色，細胞質呈紅色。模型組癌細胞緊密，核仁體積大；陽性組和復方夏枯草制劑低、中、高劑量組細胞有不同程度壞死，癌細胞數目明顯減少，且大小不一，胞質破裂，完整性不好。

2.3 各組瘤組織Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性率比較 結果見表2。

表2 各組瘤組織Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性率比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

癌癥的發(fā)病率和病死率隨著環(huán)境污染的急速加劇而逐漸升高，盡管人類的醫(yī)學水平在科技高速發(fā)展的今天有了很大提高，但是每年死于癌癥的人數還是高得驚人，因此征服惡性腫瘤已成為全世界人們的迫切愿望，也成為各醫(yī)務工作人員最緊要的任務[14]。肺癌在所有惡性腫瘤的病死率中占據首位，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。

復方夏枯草制劑由夏枯草、淫羊藿等極具特色的中草藥通過水提取法、蒸餾、濃縮制成。夏枯草味辛，性寒，常用于軟堅散結、消腫、抗腫瘤等[6,7]；當前，夏枯草無論是在抗癌方面，還是在機制研究方面，都有大量的文獻記載，其機制主要與腫瘤細胞增殖受到抑制、誘導腫瘤細胞凋亡、誘導分化、抗氧化、免疫調節(jié)、逆轉腫瘤耐藥等因素有關[8]。目前，對于夏枯草的研究匯集在體外，對于體內研究較少。淫羊藿味甘，性溫和，活性成分活躍，尤其是淫羊藿苷成分，近年來在抗腫瘤的研究中獲得顯著進展[9]。有文獻[10,11]報道，淫羊藿苷不僅能阻滯前列腺癌細胞的生長、侵襲和遷移，還能使黑色素B16腫瘤細胞發(fā)生凋亡。本研究顯示，與模型組比較，高劑量組、陽性組給藥后瘤體積、瘤重減小。模型組癌細胞緊密，核仁體積大；陽性組和復方夏枯草制劑低、中、高劑量組細胞有不同程度壞死，癌細胞數目明顯減少，且大小不一，胞質破裂，完整性不好。提示復方夏枯草制劑能抑制NCI-H460細胞裸鼠移植瘤生長，高劑量濃度效果最好。

細胞凋亡中有多種基因蛋白參與，并主要由內、外源性兩種途徑發(fā)生，其內途徑又是細胞發(fā)生凋亡的主要途徑，與線粒體緊密相關，而線粒體的內外膜間腔中含有Caspase、Bax、Bcl-2等多種涉及細胞凋亡的因子[15]。Caspase家族能夠誘導多種蛋白酶系統(tǒng)發(fā)生凋亡，在凋亡途徑中起主導作用并能匯集多條凋亡途徑，致使腫瘤細胞執(zhí)行最終凋亡命名[16]。若Caspase家族被激活，細胞內的蛋白質將被依次慢慢降解，從而致使凋亡的腫瘤細胞不再有復活的可能[17]。Caspase家族中的Caspase-3通過酶切下游底物，直接執(zhí)行細胞凋亡，Bcl-2家族能夠在線粒體途徑中主要調節(jié)控制調亡因子釋放，其中Bcl-2家族中的相關蛋白Bax能促使線粒體上通透轉運孔道的開放，從而Caspase蛋白被激活，誘導細胞調亡[18～20]。Bcl-2家族根據功能的差異主要分為兩種蛋白(抗凋亡和促凋亡)，其中抗凋亡蛋白有Bcl-2、Bcl-xL，促凋亡蛋白研究最多的有Bax、Bcl-Xs、Bad。Bcl-2家族能夠在彼此間構成二聚體形式相互調節(jié)對方細胞生與死[21,22]。本研究顯示，與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性組Bax陽性率升高，高劑量組、中劑量組、陽性組Caspase-3陽性率升高。提示中高劑量組復方夏枯草制劑是直接通過上調Bax、Caspase-3表達促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡。

總之，高劑量復方夏枯草制劑能抑制NCI-H460細胞移植裸鼠瘤體的生長，其作用機制可能是通過上調Bax、Caspase-3表達。