楊秀蓮，張瑩婷，何 嶺，李海燕，陳貢偉，王良桂

（南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037）

海州常山Clerodendrum trichotomum，別名臭梧桐，為馬鞭草科Verbenaceae大青屬Clerodendrum多年生落葉小喬木，廣泛分布在我國華北、華東、中南和西南等地，朝鮮、日本、菲律賓也有分布。海州常山花序可同時出現(xiàn)紅色花萼、粉白色花冠和蘭紫色果實，色彩豐富，加上其花香四溢、生長迅速和適應(yīng)性廣，是一種優(yōu)良的觀賞木本花卉[1-3]。海州常山推廣開發(fā)亟需進一步對其觀賞品質(zhì)進行改善，并研究培育海州常山新品種。在植物傳統(tǒng)植物育種中，雜交育種的重要手段之一為人工授粉[4-5]，輻射育種相對于雜交育種可以更方便快捷獲得植物新品種。 劉軍麗等[6]認為60Co-γ射線可使嫁接海棠幼苗表現(xiàn)出明顯的矮化，抗蟲性提高，葉面積降低，葉厚度增加，葉色加深。尹航等[7]在對庫爾勒香梨輻射效應(yīng)的研究中認為被輻射枝條嫁接第2年枝條間距增大，葉片面積減小，輻射有利于果實含糖量的增加。

近年來對海州常山的研究主要集中在抗逆性研究、藥用價值開發(fā)、無性繁殖等方面，前人幾乎沒有開展育種工作，至于以海州常山插穗為材料進行輻照育種更為鮮見。為此本研究以海州常山休眠枝條和當(dāng)年生枝條為材料，主要探討不同劑量的60Co-γ射線對海州常山扦插材料的光合特性和生長特性的影響，為掌握輻照對海州常山光合效率與產(chǎn)量的影響、豐富觀賞性狀提供理論依據(jù)；也為進一步培育海州常山品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

2017年3月6日，在南京喜悅科技股份有限公司使用γ輻照裝置（BFT14型，北京核二院比尼新技術(shù)有限公司），對海州常山休眠枝條進行輻照處理，又于2017年5月4日對海州常山嫩枝進行輻照，且均在輻照翌日扦插在南京林業(yè)大學(xué)園林實驗教學(xué)中心溫室內(nèi)。

1.2 材 料

供試材料為海州常山1年生待萌發(fā)休眠枝條和當(dāng)年生半木質(zhì)化嫩枝，取自南京林業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地。枝條剪成平均長度為9 cm的插穗，粗度0.5 cm，具備4個以上飽滿的芽體，母本生長健壯，無病蟲害。

1.3 方 法

試驗采用單因素完全隨機設(shè)計。設(shè)置0（CK）、15、25、35 Gy、4個60Co-γ射線劑量，用1.1 Gy·min-1的劑量率照射供試材料，每劑量照射3組供試插穗，每組60根插穗。輻照完成后立即將插穗用濕潤的脫脂棉包裹，扦插于基質(zhì)深15 cm的插床上，基質(zhì)以泥炭、珍珠巖、蛭石、河沙按1∶1∶1∶2的體積比配置，定期噴水保濕，插床上方3 m架蔭棚，遮陽網(wǎng)透光率40%～50%。在其生長基本停止后測量相關(guān)指標(biāo)。

1.3.1 成活率及半致死劑量的測定

2017年8年5日，用計數(shù)法測定海州常山休眠枝和嫩枝插穗成活率，扦插成活率=生根株數(shù)/總扦插株數(shù)×100%。半致死劑量參照周小梅等[8]和王趙玉等[9]的方法，通過相關(guān)系數(shù)公式來計算。

1.3.2 形態(tài)指標(biāo)的測定

從2017年8月5日起，2種輻照材料各輻照劑量選擇10株代表性單株，帶回實驗室洗凈、擦干。用軟尺測量每株新梢的長度，游標(biāo)卡尺測量新梢基部粗度，同時記錄新梢節(jié)間數(shù)，計算新梢節(jié)間長度。

節(jié)間長度=新梢長度/節(jié)間數(shù)。

每株挑選3片正常的功能葉，游標(biāo)卡尺測量葉片長度、葉片寬度，網(wǎng)格法計算葉片面積。

葉形指數(shù)=葉片長度/葉片寬度。

分離單株根系，使用根系掃描儀（ EPSON EXPERSSION V700）掃描出根系圖像，后用 Win RHIZO 圖像分析軟件分析扦插苗總根長、總根表面積和總根體積。

1.3.3 新梢枝條、葉片變異率的統(tǒng)計

從2017年8月5日起，2種輻照材料各輻照劑量選擇統(tǒng)計枝條、葉片變異情況，計數(shù)法計算海州常山枝條、葉片各變異類型變異率。

枝條變異率=變異枝條數(shù)/統(tǒng)計枝條數(shù)×100%。

葉片變異率=葉片變異數(shù)/統(tǒng)計葉片數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，在對照與各輻照劑量處理區(qū)之間進行多重對比，用Excel 2003制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ輻照對不同海州常山插穗成活率的影響

不同輻照劑量對海州常山休眠枝和嫩枝扦插成活率，見表1。由表1可知，在5個60Co-γ輻照劑量處理下，隨著劑量的增大，海州常山扦插成活率呈降低的趨勢。35 Gy處理后海州常山休眠枝扦插和嫩枝扦插相對成活率均達最低，且低于50%，分別為43.39%、47.01%。25 Gy處理后2種插穗相對成活率分別是52.84%、52.94%，15 Gy處理后為64.16%、76.44%，而0 Gy（CK）處理后的2種海州常山插穗成活率分別為88.33%、18.89%。

表1 60Co-γ輻照對不同海州常山插穗成活率及相對成活率的影響Table 1 Effects of 60Co-γ ray irradiation on survival and relative survival rate of different cuttings of C.trichotomum

2.2 不同海州常山插穗半致死劑量的計算

根據(jù)海州常山休眠枝插穗在不同劑量下的相對成活率，擬合直線回歸方程（圖1），得y=-1.615 3x+95.385，其中y為相對成活率，x為輻照劑量。根據(jù)直線回歸方程，當(dāng)y=50時，x=28.10，即海州常山休眠枝插穗的半致死劑量LD50=28.10 Gy，約為28 Gy。如圖2，通過對海州常山嫩枝輻照，再根據(jù)相對成活率和輻照劑量進行線性回歸可知其回歸方程為：y= -1.595 3x+ 99.010，y為相對成活率，x為輻照劑量，當(dāng)y=50時，x=30.72，即海州常山嫩枝插穗的半致死劑量LD50約為31 Gy。

圖1 60Co-γ輻照對海州常山休眠枝插穗相對成活率的影響Fig.1 Effects of 60Co-γ ray irradiation on relative survival rate of dormant branch cuttings of C.trichotomum

圖2 60Co-γ輻照對海州常山嫩枝插穗相對成活率的影響Fig.2 Effects of 60Co-γ ray irradiation on relative survival rate of dormant branch cuttings of C.trichotomum

2.3 60Co-γ輻照對海州常山新梢的輻照效應(yīng)

由表2可知，海州常山插穗新梢長度、新梢節(jié)間長、新梢基部粗隨著輻照劑量的增加，均呈現(xiàn)遞減的趨勢。在輻照劑量達到35 Gy后，休眠枝插穗新梢長度顯著低于對照處理（P＜0.05），較對照組降低35.61%。15～25 Gy處理后新梢長度與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。海州常山新梢節(jié)間長度隨輻照劑量增加亦呈遞減趨勢，35 Gy處理條件下休眠枝節(jié)間長度下降明顯（P＜0.05），較對照水平下降34.73%。不同輻照劑量對休眠枝插穗新梢基部粗、嫩枝插穗新梢生長影響不顯著（P＞0.05）。

表2 60Co-γ輻照對海州常山新梢生長的影響?Table 2 Effects of 60Co-γ ray irradiation on new shoots growth of C.trichotomum

2.4 60Co-γ輻照對海州常山葉形變化的影響

根據(jù)表3可以看出，海州常山葉片長度、葉片寬度、葉片面積在15～35 Gy劑量處理下，休眠枝插穗表現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢，而嫩枝插穗呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢。60Co-γ射線處理下，休眠枝插穗與嫩枝插穗葉片長度、葉片寬度、葉片面積生長有所抑制，分別在25和15 Gy出現(xiàn)谷值，其中就葉片面積分別較對照降低了30.71%和29.56%。在15 Gy處理下，休眠枝插穗葉片長度、葉片寬度、葉片面積比對照組升高了0.86%、2.80%、3.29%。對于葉形指數(shù)，輻照對其無顯著影響（P＞0.05）。

表3 60Co-γ輻照對海州常山葉形變化的影響Table 3 Effects of 60Co-γ ray irradiation on leaf shape of C.trichotomum

2.5 60Co-γ輻照對海州常山根系形態(tài)的影響

由表4可以看出，隨著輻照劑量的增大，休眠枝插穗幼苗和嫩枝插穗幼苗根系形態(tài)指標(biāo)均呈先降低后上升的趨勢。不同劑量輻照處理均可顯著降低海州常山休眠枝插穗幼苗總根長、總根表面積、總根體積（P＜0.05），而對嫩枝扦插苗影響不顯著（P＞0.05）。60Co-γ射線輻照下，休眠枝插穗幼苗根系形態(tài)總體表現(xiàn)出抑制狀態(tài)，其中在25 Gy處理下，休眠枝插穗幼苗根系形態(tài)受到的抑制最嚴重，總根長、總根表面積、總根體積較對照組分別降低了94.71%、97.03%、92.27%。60Co-γ射線輻照下，嫩枝插穗幼苗根系形態(tài)總體表現(xiàn)出升高趨勢，其中，35 Gy處理下各形態(tài)指標(biāo)達最大值，分別為對照水平的1.25倍、1.11倍、1.14倍。

表4 60Co-γ輻照對海州常山根系形態(tài)的影響Table 4 Effects of 60Co-γ ray irradiation on root morphology of C.trichotomum

2.6 60Co-γ對海州常山枝、葉形態(tài)變異的影響

根據(jù)表5，海州常山休眠枝經(jīng)輻照后，扦插苗枝變異率在5.26%～30.77%。隨著輻照劑量的增加，休眠枝插穗幼苗枝變異率呈先增后降的趨勢，未經(jīng)輻照插穗幼苗多叉扁化枝數(shù)量為0，25 Gy處理的新梢變異率最高，為30.77%，15、35 Gy處理的新梢變異率分別為5.26%、21.88%。經(jīng)輻照的嫩枝插穗枝變異率在0～25 Gy為0，分叉扁化枝僅出現(xiàn)在35 Gy處理下，枝變異率22.22%。

表5 60Co-γ輻照對海州常山枝形態(tài)變異的影響Table 5 Effects of 60Co-γ ray irradiation on branch morphology variation of C.trichotomum

根據(jù)表6，隨著輻照劑量的增加，休眠枝及嫩枝插穗幼苗葉變異率呈遞增變化趨勢，且均在35 Gy達到最大值，變異率分別為對照水平的30.37倍和12.92倍。從變異類型來看，休眠枝插穗幼苗葉片變異類型主要為，葉序紊亂（19.17%）＞葉面缺刻（13.70%）＞葉二尖（8.22%）＞葉皺（4.11%）＞葉缺綠（2.74%）＞葉柄合生（1.83%）＞葉斑（0.91%）＞窄葉（0.46%）。15 Gy處理易出現(xiàn)葉面缺刻和葉二尖現(xiàn)象，葉變異率分別為21.56%、15.69%。25、35 Gy出現(xiàn)葉序紊亂類型最多，分別占比36.17%、36.85%。

嫩枝插穗幼苗變異類型主要為葉皺（2.59%）＞葉缺刻（2.04%）＞葉序紊亂（1.36%）葉缺綠(1.23%)＞葉二尖(0.27%)＞葉柄合生(0.14%)＞葉斑（0.14%）。15 Gy易出現(xiàn)葉皺和葉面缺刻類型，變異率分別為4.87%、2.21%。25 Gy葉皺、葉缺綠類型較多，變異率都為2.50%。35 Gy出現(xiàn)葉序紊亂、葉面缺刻變異類型，變異率分別為3.25%、2.44%。

表6 60Co-γ對海州常山葉片形態(tài)變異的影響Table 6 Effects of 60Co-γ ray irradiation on leaf morphology variation of C.trichotomum

4 結(jié)論與討論

輻照誘變主要是通過射線輻照誘使植物材料發(fā)生遺傳物質(zhì)改變，從而達到表型性狀的變異，是選育新品種的有效途徑。輻照劑量過低對植物的遺傳物質(zhì)起不到有效的誘變作用，高劑量的輻照會誘變高突變率，但死亡率亦會增加。而且不同的輻照劑量對不同植物和不同來源的植物器官誘變效應(yīng)不一樣，所以選擇合適輻照劑量對輻照誘變育種尤為重要[10-11]。一般采用半致死劑量作為輻照育種的合適劑量。本研究中，60Co-γ射線輻照海州常山插穗，輻照劑量與插穗的成活率呈負相關(guān)。史玉敏等[12]以桂花扦插枝條為輻照材料研究輻照誘變效應(yīng)及其耐輻照性，發(fā)現(xiàn)隨輻照劑量的增大成活率有下降趨勢，當(dāng)輻照劑量超過35 Gy 時，桂花的成活率均低于50%。這些在對金銀花[13]、扶芳藤[14]、梔子[15]等的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。60Co-γ射線輻照會對芽分生組織造成不同程度的損傷，直接導(dǎo)致芽萌發(fā)緩慢或芽不萌發(fā)，甚至芽直接死亡，插穗會因體內(nèi)養(yǎng)分耗盡或細胞大量的損傷而死亡[16]。

此外，本試驗根據(jù)輻照后插穗的相對成活率得出休眠枝插穗半致死劑量為28 Gy，嫩枝插穗的半致死劑量為31 Gy，不同扦插材料適宜輻照劑量具有差異性。前人在對荔枝枝條輻照研究中發(fā)現(xiàn)，不同品種、不同時期的荔枝枝條受60Co-γ射線輻照的耐受能力和變異差異區(qū)別很大，這種輻照敏感性差異的現(xiàn)象可能與植物的進化程度、倍性水平、核體積、生長及生理代謝狀況等因素有關(guān)[17-18]。對于半致死劑量的確定，耿興敏等[19]認為潢川金桂、米花籽銀桂和金盞碧珠的適宜輻照劑量不能僅考慮發(fā)芽率，還需結(jié)合其出苗率及幼苗生長情況，適當(dāng)降低輻照劑量，以保證出苗率。葉開玉認為[20]用相對成活率來確定輻照適宜劑量更為準確，可避免試驗操作造成的誤差和錯誤。但也有研究表明以半致死劑量上下20%的范圍內(nèi)再選擇2個劑量，作為產(chǎn)生有益突變的最佳輻照劑量[21]。本研究采用扦插材料相對成活率50%的輻照劑量為半致死劑量，此次試驗海州常山嫩枝扦插成活率偏低，這可能因為扦插季節(jié)不適宜，可適當(dāng)推遲扦插時間來保證插穗的成活率。

60Co-γ射線輻照對植物的生長影響因材料的不同和輻照劑量大小而異。劉軍麗[6]在研究蘋果屬觀賞海棠中發(fā)現(xiàn)，100 Gy劑量的輻照會抑制其1年生枝新梢和葉片生長，使葉面積降低。在對金帥、嘎拉蘋果1年生枝條輻照中也有類似報道，40～80 Gy范圍內(nèi)的輻照會使新生枝條變短，葉片變窄[22]。本試驗中，15～35 Gy的60Co-γ射線輻照抑制了海州常山休眠枝插穗新梢長度、新梢基部粗度、葉面積及地下根系的生長，但15～35 Gy的輻照對嫩枝插穗無明顯影響，僅對其地下根系總長度、總表面積和總體積的生長起到了一定的促進作用，這可能為本試驗?zāi)壑Σ逅胍秆窟€處于被頂芽抑制的狀態(tài)，對外界輻照刺激不敏感的緣故。這在仙客來[23]輻射育種中也有類似現(xiàn)象，輻射塊莖比愈傷組織、體細胞胚等更能有效改變花色的性狀。

此外，在一定的隨輻照劑量范圍內(nèi)，枝、葉變異率隨著輻照劑量的升高而升高，這與嘎拉蘋果輻照效應(yīng)研究結(jié)論相似，超出一定的劑量變異率會降低，高劑量輻照會提高插穗死亡率，從而降低了變異率[24]。輻照對葉片影響方面，庫爾勒香梨[7,25]枝條在輻照劑量為20 Gy時變異率達30%，60 Gy時變異率達100%，變異葉片形態(tài)有兩尖葉、半葉、葉片缺刻、葉緣波狀等，此外還有葉序的紊亂等變異，變異類型多呈不規(guī)律變化。月季[26]植株經(jīng)輻照葉片發(fā)生了葉柄發(fā)生粘連、葉片變得狹小、畸形等現(xiàn)象。本研究葉片變異情況與之相似。至于枝、葉變異類型發(fā)生輻照劑量之間的規(guī)律是否存在，尚待進一步研究。

本試驗研究了60Co-γ射線對海州常山休眠枝、嫩枝插穗生長及變異的影響，為海州常山輻射育種提供了一定的理論基礎(chǔ)。但隨著生長進程的推遲，新生枝條、葉片變異性狀逐漸消失，變異性狀穩(wěn)定性尚不明確，需逐代篩選，為加快輻射育種變異植株早期的篩選，可采用分子手段檢測海州常山遺傳分化狀況。另外，海州常山輻射育種可以向抗蟲害方向進行研究。