鄧慶梅，周利利，郭思佳，陳津津，郭立鈺，曾凡軍，周海勝,3

果蠅頭狀因子(grainyhead-like，GRHL)基因家族高度保守，所編碼的轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵的調(diào)控作用。果蠅頭狀因子3(grainyhead like-3，GRHL3)是 Grainyhead基因家族成員之一，參與哺乳動物表皮的發(fā)育和修復[1-5]。基因組測序發(fā)現(xiàn)在非綜合性腭裂的家族發(fā)生GRHL3基因突變并影響血管內(nèi)皮細胞的遷移過程[6-8]。

研究[9]證實，在早期乳腺癌中GRHL3表達量升高；乳腺癌及肺癌細胞GRHL3可以通過正調(diào)控上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達，抑制間質(zhì)細胞上皮細胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[10-11]。但GRHL3也可以結合E-cadherin基因啟動子抑制其表達，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[12]。因此GRHL3調(diào)控靶基因的種類及其調(diào)控方式存在較大差異性。該研究以皮膚鱗癌細胞A431作為研究對象，建立過量表達GRHL3的細胞株，以搜尋GRHL3調(diào)控皮膚鱗癌細胞遷移和侵襲相關的靶基因。

1 材料與方法

1.1組織標本、細胞系與載體人正常皮膚組織標本(3例)由安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院病理科提供。皮膚癌組織芯片標本購自西安艾麗娜生物科技有限公司(SK804)。其中SCC組織標本17例，包括4例T1M0N0、9例T2M0N0、4例T3M0N0；SCC癌旁組織標本10例。人SCC細胞系A431由本實驗室保存。pCMV-2B-FLAG-vector載體購自美國Promega公司。攜帶人GRHL3 cDNA的重組表達載體pCMV-2B-FLAG-GRHL3由本實驗室構建。

1.2試劑高糖DMEM培養(yǎng)基和青霉素/鏈霉素雙抗試劑購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自美國Corning公司；TRIzol試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；鼠源抗GAPDH的抗體購自美國Abcam公司；兔源抗GRHL3的抗體購自美國Novus公司(NBP1-8035)；兔源抗FLAG的抗體購自美國Sigma公司(F1804-200UG)；用于免疫組化的二抗、DAB顯色試劑盒自北京中杉金橋生物技術公司；G418購自美國Santa cruz公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生生物公司；ChIP試劑盒購自美國Cell Signaling Technologies公司(#9002)；基質(zhì)膠和Boyden小室購自美國BD Biosciences公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 人SCC細胞系A431細胞用含10%熱失活的胎牛血清(FBS)和1%青、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2細胞系構建 將狀態(tài)良好的A431細胞傳代后接種至6孔板中，并用含血清不含雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)。第2天用Lipofectamine 3000將過表達載體pCMV-2B-FLAG-GRHL3及對照組載體pCMV-2B-FLAG-vector轉(zhuǎn)染A431細胞。2 d后加入400 μg/ml G418篩選3～4周，構建穩(wěn)定過量表達GRHL3的細胞系。

1.3.3表達譜芯片檢測和分析 利用TRIzol試劑盒提取A431細胞和過量表達GRHL3的A431細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。由上?？党缮镉邢薰具M行RNA表達譜檢測，差異表達基因篩選利用NimbleScan RMA(Version 2.5)軟件進行分析。差異表達基因的篩選標準為：與對照組比較，基因表達水平相差2倍以上(Fold change≥2.0)為候選基因。聚類分析利用在線分析網(wǎng)站http://pantherdb.org/。

1.3.4染色質(zhì)免疫共沉淀-測序分析(chromatin immunoprecipitation-sequcing, ChIP-seq) 利用抗Flag抗體，根據(jù)ChIP試劑盒按照說明書操作，捕獲GRHL3結合的DNA，送上?？党缮镉邢薰具M行DNA測序。GRHL3結合峰分析使用Model-based Analysis of ChIP-seq(MACS version 1.4)軟件進行分析。GRHL3調(diào)控候選基因聚類分析利用在線分析軟件http://pantherdb.org/。

1.3.5Western blot 去除細胞培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入細胞裂解液，收集細胞冰上裂解30 min。裂解液用恒溫金屬浴100 ℃、10 min，使蛋白變性。加樣后進行聚丙烯酰胺凝膠(10%)電泳。再以恒流170 mA轉(zhuǎn)膜約1.5 h。PVDF膜用5%脫脂牛奶的封閉液封閉約40 min。分別加入對應的一抗包括GAPDH(1 ∶5 000)、GRHL3(1 ∶1 000)和FLAG抗體(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜。次日用1×TBST緩沖液漂洗3次，加入二抗(1 ∶5 000)孵育6 h，增強化學發(fā)光法X膠片曝光顯影。

1.3.6Transwell侵襲實驗和遷移實驗 侵襲實驗：基質(zhì)膠用培養(yǎng)基稀釋8倍，將膠加入小室，每個小室加50 μl，靜置過夜。細胞調(diào)整為2.0×105/ml，取200 μl加至上室，下室加600 μl的5% FBS培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出小室，甲醇固定20 min，蘇木精染色10 min，洗滌，伊紅染色2 min，沖洗后擦去上層細胞，制片，計數(shù)。遷移實驗：小室不用基質(zhì)膠處理，其他方法與侵襲實驗相同。

1.3.7免疫組織化學分析 根據(jù)參考文獻[13]方法, 組織標本用5%多聚甲醛固定15 d，脫水包埋，切片(4 μm)脫蠟入水微波加熱進行抗原修復，3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化氫酶，滴加一抗(1 ∶200)4 ℃過夜，先后滴加試劑1和試劑2，37 ℃孵育15 min，DAB顯色，自來水沖洗、復染、脫水、透明、封片。

2 結果

2.1SCC組織GRHL3表達利用免疫組織化學方法檢測收集的SCC組織標本的GRHL3的表達。結果顯示：正常皮膚組織中GRHL3的表達水平較低，僅僅局限于皮膚基底層的角質(zhì)形成細胞表達；而皮膚癌旁組織GRHL3表達較正常皮膚組織明顯增加，而對于皮膚癌組織中GRHL3表達水平較癌旁組織顯著增加。見圖1。對癌旁組織和不同病例分期的皮膚癌組織分析顯示，10例癌旁組織中GRHL3均有表達；而TNM分期的病例組織中，4例T3N0M0的GRHL3表達均為陽性， T2N0M0的癌組織GRHL3陽性率為88.9%， T1N0M0的癌組織GRHL3陽性率為75.0%。見表1。提示GRHL3的表達可能與皮膚鱗癌的分期有關，并且可能參與皮膚鱗癌發(fā)生發(fā)展過程。

表1 皮膚鱗癌病理分期與GRHL3表達[%(n)]

2.2過表達GRHL3促進A431細胞的侵襲和遷移將帶有FLAG標簽用于過量表達GRHL3的表達載體pCMV-2B-FLAG-GRHL3轉(zhuǎn)染到A431細胞，構建穩(wěn)定過量表達GRHL3的細胞系A431/GRHL3；同時將對應的空載pCMV-2B-FLAG-vector轉(zhuǎn)染A431作為對照組細胞(A431/Vec)。Western blot結果顯示：轉(zhuǎn)染GRHL3的A431細胞中可以明顯檢測到FLAG標簽和GRHL3的過量表達，見圖2A，提示成功構建過量表達GRHL3細胞系。將A431/Vec和A431/GRHL3的細胞進行Transwell侵襲和遷移實驗。過量表達GRHL3的A431細胞的侵襲能力和遷移能力較對照組細胞明顯增加。見圖2B。計算單個視野內(nèi)穿孔的細胞數(shù)，結果顯示過量表達GRHL3的侵襲細胞數(shù)為14.8，對照組穿孔細胞數(shù)為6.7，差異有統(tǒng)計學意義(F=15.40，P<0.001)；過量表達GRHL3的遷移細胞數(shù)為43.7，而對照組遷移的穿孔細胞數(shù)13.8，差異有統(tǒng)計學意義(F=301.19，P<0.001)。見圖2C。

2.3表達譜芯片分析提取過量表達GRHL3的A431細胞和對照組細胞的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進行基因表達譜分析。結果顯示：與對照組細胞比較，過量表達GRHL3導致表達水平變化2倍以上的基因總數(shù)為5 207個。見表2。在這些差異表達的基因中，細胞運動相關分子57個，細胞黏附相關分子72個。經(jīng)過比較表明CDH3分子具有調(diào)控細胞運動和細胞黏附的功能。因此與細胞侵襲和遷移密切相關的分子為128個。

2.4ChIP-seq檢測GRHL3的調(diào)控基因利用建立的穩(wěn)定過量表達Flag-GRHL3的A431細胞，以Anti-Flag 抗體通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術捕獲DNA進行DNA測序。GRHL3在基因組上結合峰是以結構基因轉(zhuǎn)錄起始點為中心，分別分析結構基因啟動子區(qū)結合峰(±2.0 kb)、上游結合結合峰(-2.0～-20.0 kb)、基因間區(qū)結合峰、內(nèi)含子結合峰、外顯子結合峰。見圖3A。GRHL3在基因組中特異性結合的DNA分布。見圖3B。其中，GRHL3結合的主要位置是在基因間區(qū)(55.65%)，只有2.49%位于結構基因的啟動子區(qū)域。通過測序證實受GRHL3調(diào)控的靶基因的數(shù)量達到5 702個，與細胞侵襲和遷移密切相關的基因為149個。見圖3C。其中，細胞運動相關分子65個，細胞黏附相關分子84個。GRHL3過量表達A431細胞的基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)128個差異表達基因與細胞侵襲和遷移密切相關，其中有26個基因與ChIP-seq提示的GRHL3調(diào)控細胞侵襲和遷移相關候選靶基因具有一致性。

圖1 免疫組織化學檢測GRHL3表達

圖2 過量表達GRHL3促進A431細胞侵襲和遷移

A：Western blot檢測GRHL3過量表達；B：Transwell細胞侵襲和遷移×100；C：A431過量表達GRHL3對細胞侵襲和遷移的影響；與對照組A431/Vec比較：***P<0.001

表2 A431/GRHL3細胞的差異表達基因及GRHL3調(diào)控基因的聚類分析

*GO：Gene Ontology(基因本體數(shù)據(jù)庫)

圖3 ChIP-seq分析GRHL3在基因組上結合位點及其調(diào)控的候選基因

A：ChIP-seq分析GRHL3在基因組DNA的結合位置；B：GRHL3在基因組DNA結合區(qū)域分布；C：A431/GRHL3細胞侵襲和遷移相關差異表達基因與ChIP-seq提示GRHL3調(diào)控細胞侵襲和遷移的候選基因比較;TSS：transcription start site(轉(zhuǎn)錄起始位點)

3 討論

GRHL3作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，在果蠅和小鼠體內(nèi)主要參與調(diào)控多種表皮屏障形成及終末分化有關。研究[1-4]表明GRHL3主要在外胚層細胞尤其是上皮細胞的分化和遷移過程中發(fā)揮作用，例如，GRHL3-/-小鼠天生眼臉閉合不全，而且有神經(jīng)管閉合障礙。因此，GRHL3可以促進外胚層上皮遷移，從而修復早期上皮閉合過程中的上皮缺陷。由此提示GRHL3可能與腫瘤細胞的遷移或侵襲具有相似性。GRHL3在上皮來源腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用存在爭議。如敲除小鼠角質(zhì)形成層細胞中的GRHL3，可誘發(fā)SCC的發(fā)生[13]，其原因可能是GRHL3敲除的角質(zhì)形成細胞分化與增殖平衡受到破壞，導致對化學誘導腫瘤的敏感性升高。而在非三陰性乳腺癌及晚期小細胞肺癌和肺腺癌的組織中，GRHL3表達量升高[10-11]。同時，有研究[14]證實GRHL3可以結合miR-21基因啟動子抑制腫瘤發(fā)生。可見GRHL3可能是一種原癌基因。組織免疫化學的方法檢測顯示正常皮膚組織中GRHL3主要表達在皮膚角質(zhì)形成細胞，可能參與正常皮膚的角質(zhì)形成細胞向表皮層遷移；而癌旁組織和癌組織中GRHL3表達明顯高于正常皮膚組織，提示GRHL3表達與SCC的遷移和侵襲有關。為證實GRHL3對SCC細胞的遷移和侵襲能力的影響，選擇低遷移和低侵襲能力的皮膚鱗癌細胞系A431作為研究的細胞模型，并建立了過量表達GRHL3的細胞株。與對照組比較，過量表達GRHL3的細胞株遷移能力和侵襲能力顯著增加。

研究[11]顯示GRHL3在正常小鼠的乳腺導管上皮細胞、乳腺癌細胞及肺癌細胞通過正調(diào)控E-cadherin的表達，促進間質(zhì)細胞-上皮細胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生。然而，前期研究[12]證實GRHL3可以結合E-cadherin的啟動子，抑制E-cadherin表達，進而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。因此GRHL3作為轉(zhuǎn)錄因子，在不同類型的腫瘤及腫瘤的不同階段，調(diào)控腫瘤細胞的侵襲和遷移相關的靶基因及其調(diào)控機制目前仍不清楚。為了研究GRHL3上調(diào)SCC遷徙和侵襲的分子機制，通過基因表達譜分析顯示：GRHL3過量表達導致A431細胞有128個基因表達變化與細胞侵襲和遷移密切相關。進一步通過ChIP-seq分析顯示GRHL3在調(diào)控靶基因表達時，其結合部位主要分布于結構基因的基因間區(qū)，僅有少數(shù)靶基因是依賴于調(diào)控啟動子活性而影響其表達。其原因可能是在基因間區(qū)或內(nèi)含子區(qū)域存在靶基因的增強子或沉默子[15]，GRHL3可能與調(diào)控這些順式作用元件的活性有關。GRHL3調(diào)控參與細胞侵襲和遷移的基因數(shù)為149個。其中有26個基因與基因表達譜差異表達基因一致。提示這26個與腫瘤細胞的遷移和侵襲相關的基因可能是GRHL3調(diào)控的候選靶基因。

利用表達譜芯片分析和ChIP-seq分析技術篩選獲得GRHL3調(diào)控的候選靶基因，有助于后續(xù)進一步驗證這些候選靶基因?qū)CC細胞的遷移和侵襲的作用，并有利于揭示GRHL3調(diào)控SCC的遷移和侵襲的作用機制。