何美倫，徐愛暉

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycosylation end products，RAGE)是免疫球蛋白家族中的一員，作為一種多配體的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，通過與細(xì)胞表面不同配體結(jié)合發(fā)揮功效[1]。其高表達(dá)與糖尿病血管性病變、神經(jīng)退行性變、急性肺損傷以及腫瘤的發(fā)生與惡變密切相關(guān)[2-5]。RAGE的胞內(nèi)端重要信號(hào)分子DIAPH1( diaphanous-realted formin 1)是Formin蛋白家族中的一員，同時(shí)為Rho蛋白效應(yīng)器。RAGE胞內(nèi)段通過DIAPH1的FH1區(qū)域與其相互作用，并通過激活小G蛋白家族Rho蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞遷移[6]。研究[7]表明，RAGE及DIAPH1在多類惡性腫瘤中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及浸潤，但是目前尚未有研究探究DIAPH1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及RAGE對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的調(diào)控情況。該研究將從分子信號(hào)水平檢測RAGE及DAIPH1在肺腺癌細(xì)胞株A549中的表達(dá)，探討RAGE的胞外配體對其遷移、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人肺腺癌細(xì)胞A549購自美國ATCC；人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B 購自美國Sigma公司。

1.1.2儀器和試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖劑、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗、EDTA-胰酶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國ThermoFisher公司)；BEGM支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液、支氣管上皮細(xì)胞傳代試劑(美國Lonza公司)；RNA提取試劑盒(美國QIAGEN公司)；cDNA合成試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠、Western blot電泳緩沖液(10×)、Western blot轉(zhuǎn)膜緩沖液(10×)、PVDF膜(美國Bio-Rad公司)；DIAPH1抗體(美國BD公司)；GAPDH抗體(美國Abcam公司)；Rage抗體(美國Gene Tex公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng) 在無菌超凈臺(tái)中預(yù)備2個(gè)無菌的75 cm2培養(yǎng)瓶，將A549細(xì)胞株和BEAS-2B復(fù)蘇后分別加入含10% FBS以及1%雙抗的DMEM和BEGM完全培養(yǎng)基。置入含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞密度長到95%左右時(shí)，以0.25% EDTA-胰酶消化傳代，取生長狀態(tài)良好的第2代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCR檢測 將呈對數(shù)生長期的A549及BEAS-2B以8×103/cm2分別接種至6孔板中。待細(xì)胞匯合至95%時(shí)，使用QIAGEN 試劑盒提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用美國Thermo Fisher公司所提供的引物及Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為校正標(biāo)本中RNA質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄效率的差異，將標(biāo)本檢測所得到的Ct值與相應(yīng)的18SrRNA基因Ct值相減進(jìn)行標(biāo)化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western blot檢測 將呈對數(shù)生長期的A549及BEAS-2B以8×103/cm2分別接種至6孔板中。待細(xì)胞匯合至95%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，以細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白。以BCA法測定蛋白濃度后計(jì)算出含有30 μg蛋白的溶液體積，加入4×上樣緩沖液及10×reducing buffer，最終定容為30 μg/30 μl樣品，置于95 ℃加熱孔中5 min，使蛋白變性。使用4%～15%聚丙酰胺凝膠分離膠電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)膜后封閉，一抗孵育、二抗結(jié)合，使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。為校正蛋白質(zhì)樣品中的質(zhì)量，用所得GAPDH蛋白信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化所測得的RAGE及DIAPH1蛋白信號(hào)。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)佳的A549細(xì)胞以5×104/ml，將細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞匯合率達(dá)到90%時(shí)，將細(xì)胞饑餓。用無菌黃槍頭在12孔板底部中間輕輕劃出“丨”字型傷口后加入含不同濃度的CML-AGE(10、100 μg/ml)及不同濃度的S100B(1、10、100 μg/ml)10% FBS完全培養(yǎng)基，設(shè)立不含刺激物的BLANK組，并以O(shè)dyssey光學(xué)倒置顯微鏡在0 h及16 h進(jìn)行拍照，利用ImageJ軟件測量劃痕間距離。

1.2.5凋亡檢測 取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)佳的A549細(xì)胞，以8×103/cm2將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞匯合率達(dá)到90%時(shí)，加入含不同濃度的CML-AGE(25、50、100 μg/ml)10% FBS完全培養(yǎng)基，設(shè)立不含刺激物的BLANK組。24 h后，利用前述方法提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄cDNA。使用美國ThermoFisher公司所提供的BCL-2及BAX引物及Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為校正標(biāo)本中RNA質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄效率的差異，將標(biāo)本檢測所得到的Ct值與相應(yīng)的18S基因Ct值相減，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1A549細(xì)胞中RAGE及DIAPH1mRNA表達(dá)水平經(jīng)qRT-PCR檢測結(jié)果表明，肺腺癌細(xì)胞A549中RAGE及DIAPH1的mRNA表達(dá)水平(0.570±0.057、0.421±0.028)較支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B(1.064±0.092、1.045±0.080)表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.001)。見圖1。

圖1 qRT- PCR檢測A549及BEAS-2B中RAGE與DIAPH1的表達(dá)

A:RAGE；B：DIAPH1；與BEAS-2B比較：***P<0.001

2.2A549細(xì)胞中RAGE及DIAPH1蛋白表達(dá)水平經(jīng)Western blot檢測兩組細(xì)胞中RAGE及DIAPH1蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行灰度值分析。結(jié)果顯示，肺腺癌細(xì)胞A549中RAGE及DIAPH1的蛋白表達(dá)水平(0.381±0.073、0.351±0.115)較支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B(1.000±0.089、1.000±0.020)表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.001)。見圖2。

圖2 Western blot檢測A549及BEAS-2B中RAGE與DIAPH1的表達(dá)

A:RAGE；B：DIAPH1；與BEAS-2B比較：***P<0.001

圖3 RAGE配體對A549細(xì)胞遷移能力的影響

圖4 CML-AGE對A549細(xì)胞凋亡能力的影響

2.3RAGE配體對A549細(xì)胞遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以不同濃度RAGE配體CML-AGE及S100B刺激A549肺腺癌細(xì)胞株。16 h后，與BLANK組(0.567±0.004)相比，CML-AGE實(shí)驗(yàn)組(0.495±0.037、0.387±0.015，F(xiàn)=12.23，P<0.001)及S100B實(shí)驗(yàn)組(0.523±0.032、0.405±0.024、0.343±0.018，F(xiàn)=14.45，P<0.001)對細(xì)胞遷移能力有明顯抑制作用，其作用呈現(xiàn)出濃度依賴性。見圖3。

2.4CML-AGE對A549細(xì)胞凋亡能力的影響qRT-PCR檢測結(jié)果表明，以不同濃度RAGE配體CML-AGE 刺激A549肺腺癌細(xì)胞株后，相比于BLANK組，CML-AGE刺激組中抗凋亡基因BCL-2表達(dá)下調(diào)(1.002±0.029、0.612±0.065、0.871±0.030、0.656±0.012，F(xiàn)=22.22，P<0.001);促凋亡基因BAX表達(dá)上調(diào)(1.003±0.027、1.099±0.036、1.375±0.046、1.764±0.160，F(xiàn)=17.50，P<0.001)，其作用呈現(xiàn)出濃度依賴性。見圖4。

3 討論

Jemal et al[8]在Cancer statistics中指出，肺癌是造成全世界發(fā)病率及死亡率較高的主要原因之一，目前已成為全世界死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類的生命健康。除此以外，肺癌患者的五年生存率僅約為18%，正因?yàn)榉伟┰谄湓缙陔A段對周圍血管造成的浸潤，進(jìn)一步導(dǎo)致其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使得患者失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。因此，尋找控制肺癌的浸潤轉(zhuǎn)移的有效治療靶點(diǎn)變得極為重要。

晚期糖基化終產(chǎn)物受體，又稱RAGE，是免疫球蛋白家族中的一員，作為一種多配體的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，通過細(xì)胞外段與細(xì)胞表面不同配體結(jié)合發(fā)揮功效。既往研究[9-10]表明，RAGE在正常肺組織，尤其是肺泡I型上皮細(xì)胞中的表達(dá)較高，而在肺癌組織中，RAGE的表達(dá)較正常肺組織明顯下調(diào)，其下調(diào)原因尚未明確。

近年來有研究表明，RAGE除了與細(xì)胞外配體結(jié)合，其與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的結(jié)合在信號(hào)傳導(dǎo)的過程中同樣起重要作用。有學(xué)者研究[6]證實(shí)，RAGE胞內(nèi)段通過DIAPH1的FH1區(qū)域與其相互作用，并通過激活小G蛋白家族Rho蛋白，尤其是Rac1及Cdc42誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。DIAPH1在多項(xiàng)惡性腫瘤，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及浸潤[11-13]，但其在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況尚未明確。在本研究中，選用肺腺癌細(xì)胞A549為實(shí)驗(yàn)組，以人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B為對照組，在無刺激的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取細(xì)胞中的全部RNA及蛋白質(zhì)。通過qRT-PCR及Western blot檢測RAGE及DIAPH1的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果表明，在肺腺癌細(xì)胞A549中，RAGE的mRNA及蛋白質(zhì)水平較BEAS-2B細(xì)胞明顯下降(P<0.001)。該結(jié)果與此前多項(xiàng)研究[8-9]結(jié)果相符合。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)首次檢測出在肺腺癌細(xì)胞A549中，DIAPH1的mRNA及蛋白質(zhì)水平較BEAS-2B細(xì)胞也明顯下降(P<0.001)，結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了既往研究中對于RAGE在肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低的假說。并通過在肺腺癌細(xì)胞中DIAPH1和RAGE表達(dá)同時(shí)降低，為RAGE與DIAPH1在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合并進(jìn)一步激活信號(hào)通路提供證據(jù)。

研究[10]顯示，在非小細(xì)胞肺癌患者組織標(biāo)本中RAGE表達(dá)較正常對照組明顯下降，同時(shí)其下調(diào)水平與TNM腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)性。由此可推測，激活RAGE后非小細(xì)胞肺癌惡性程度越低，腫瘤細(xì)胞遷移能力越弱。本試驗(yàn)中，選用RAGE的胞外配體CML-AGE、S100B作為刺激物，探究其在不同濃度情況下對肺腺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響。結(jié)果顯示，相比于無RAGE配體刺激的BLANK組，CML-AGE及S100B刺激組對腫瘤細(xì)胞遷移有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性(P<0.01)。結(jié)果提示激活RAGE的表達(dá)可一定程度抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移，從而可以減緩其轉(zhuǎn)移速度。本研究顯示，RAGE在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)低于在正常肺支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)，且與細(xì)胞遷移能力有關(guān)，提示RAGE與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為臨床上一項(xiàng)判斷腫瘤惡性程度和是否轉(zhuǎn)移的輔助指標(biāo)。

惡性腫瘤的發(fā)展過程可視為細(xì)胞生長/細(xì)胞凋亡失衡所造成的結(jié)果，過度表達(dá)抗凋亡基因或低表達(dá)促凋亡基因，都會(huì)造成細(xì)胞的非正常死亡減少，從而引發(fā)惡性腫瘤。研究[14-15]表明，惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)BCL-2表達(dá)上調(diào)、BAX表達(dá)下調(diào)，并且認(rèn)為下調(diào)BCL-2/BAX比率可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究中，使用qRT-PCR 檢測經(jīng)RAGE配體CML-AGE及S100B刺激后A549細(xì)胞中二者的表達(dá)。結(jié)果顯示，肺腺癌細(xì)胞A549中BCL-2的表達(dá)明顯下降且BAX的表達(dá)明顯上調(diào),其作用呈現(xiàn)出濃度依賴性(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激活RAGE后，可一定程度促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示RAGE在非小細(xì)胞肺癌的生長及凋亡中起重要作用，也為今后非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。但非小細(xì)胞肺癌組織中RAGE和DIAPH1表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制以及其與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、遷移的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。