劉云潔，程 瑋，李 麗，顧 萌，徐 濤

肝纖維化是指病理因素所致肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積的一個慢性肝損傷的病理過程[1-2]。若缺乏有效的干預(yù)手段，可最終發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌[3]。肝纖維化的標(biāo)志是肝星狀細(xì)胞活化的過程，LX-2細(xì)胞是一種穩(wěn)定的來源于人的肝星狀細(xì)胞，曾被廣泛地用作研究肝纖維化的細(xì)胞模型[4]。通常肝星狀細(xì)胞的活化過程中伴隨炎癥因子的升高，而炎癥反應(yīng)又是引起纖維化的重要病理因素，因此探究炎癥因子分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制具有潛在的臨床意義[5]。干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)是干擾素調(diào)節(jié)因子家族的重要成員，是合成I型干擾素的關(guān)鍵分子，在免疫防御系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用[6]。近年來，IRF3在肝臟疾病中屢見報道[7-8]，表明IRF3是一個調(diào)控肝臟疾病的關(guān)鍵分子，該研究旨在探究IRF3在星狀肝細(xì)胞中對炎癥因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系LX-2細(xì)胞系受贈于Dr. Scott Friedman(美國紐約西奈山醫(yī)學(xué)院)。 LX-2細(xì)胞在采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(105 U/L青霉素和100 g/L)培養(yǎng)，在含5% CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱條件(37 ℃)下孵育。LX-2細(xì)胞貼壁生長，胰酶消化后取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品和試劑腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(美國R&D Systems公司)； TRIzol(日本TaKaRa公司)；BCA法蛋白濃度定量試劑盒(武漢生物科技有限公司)；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、脂多糖(LPS)、DMSO(美國Sigma公司)；PVDF 膜(北京Solarbio 公司)；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國GBICO公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、RIPA細(xì)胞強(qiáng)裂解液、蛋白酶抑制劑(PMSF)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol (美國Invitrogen公司)；qRT-PCR引物的合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國MBI Fermentas公司)；質(zhì)粒pcDNA3-IRF3空載體pcDNA3(美國Addgene公司)；TNF-α單克隆抗體(美國Abcam公司)；核因子抑制蛋白(kappa B inhibitor protein,IκB)、p-IκB、白介素6(interleukin-6, IL-6)單克隆抗體(南京巴傲德公司)；p-p65、IRF3(美國Cell Signaling Technology公司)；p65、β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化酶標(biāo)記抗兔和抗鼠IgG(北京中杉金橋公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)。

1.3主要儀器NAPCO-6100型細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自美國SHELLAB公司；SWCJ-1F型單人雙面超凈工作臺購自江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MLS—3020型自動高壓滅菌鍋購自日本Sanyo公司；3-16K型高速冷凍離心機(jī)購自美國Sigma公司提供；PCR梯度擴(kuò)增儀購自德國Eppendoff公司；十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 儀購自美國BioRad公司；Real-time PCR system購自美國熱電公司。

1.4Westernblot法檢測LX-2細(xì)胞用冷RIPA細(xì)胞裂解液加蛋白酶抑制劑PMSF冰上裂解，30 min后收集細(xì)胞裂解渾濁液，再于高速離心機(jī)4 ℃、12 000 r/min離心30 min，吸取上清液，用BCA法蛋白濃度定量試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品，在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，再電轉(zhuǎn)移到活化的PVDF膜上，室溫下在5%脫脂奶粉中在搖床上封閉3 h，洗凈封閉液后加入一抗，于4 ℃冰箱中過夜。次日用TBST緩沖液洗凈一抗，再用含辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，TBST緩沖液洗凈二抗，最后用ECL發(fā)光劑進(jìn)行檢測，曝光、顯影。以β-actin作為內(nèi)參，分別以目的蛋白與β-actin光密度比值作為該目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5qRT-PCR法檢測按TRIzol試劑說明書提取得到LX-2細(xì)胞總RNA，再立即用紫外分光光度計測定總RNA濃度，測定A260/A280比值, 重復(fù)3次, 測得該比值穩(wěn)定于1.8～2.0?？偟腞NA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，于10 μl體系上qRT-PCR system檢測目的基因，β-actin用作內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-IRF3LX-2細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基DMEM中饑餓12 h，然后取約2×105～3×105個/ml細(xì)胞接種在6孔板中，正常培養(yǎng)，次日按照LipofectamineTM2000說明書方法轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pcDNA3-IRF3和空載體pcDNA3，6 h后棄去Optim-MEM, 換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用Western blot和qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié)果

2.1IRF3在LPS誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中表達(dá)受到抑制用2 μg/ml LPS刺激LX-2細(xì)胞不同時間后，如圖1和圖2所示，Western blot和qRT-PCR結(jié)果表明IRF3在LPS刺激后12 h，與正常組比較，蛋白和基因水平上明顯受到抑制(F=18.845，P<0.01；F=

圖1 IRF3在LPS誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

1：正常組；2：LPS刺激6 h組；3：LPS刺激12 h組；4：LPS刺激24 h組；與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 IRF3在LPS誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中的mRNA表達(dá)

1：正常組；2：LPS刺激6 h組；3：LPS刺激12 h組；4：LPS刺激24 h組；與正常組比較：**P<0.01

27.922，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。炎癥因子TNF-α在LPS刺激12 h后，蛋白和基因表達(dá)量則明顯上調(diào)(F=176.32，P<0.01;F=184.21，P<0.01)；IL-6在LPS刺激12 h后，蛋白和基因表達(dá)量也明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.998，P<0.01;F=177.01，P<0.01)。

2.2IRF3抑制炎癥因子的釋放根據(jù)上述結(jié)果，選擇用2 μg/ml LPS刺激LX-2細(xì)胞12 h用于實(shí)驗(yàn)。如圖3、4、5所示，Western blot、qRT-PCR及ELISA結(jié)果顯示，與正常組比較，IRF3在LPS刺激下12 h后表達(dá)顯著下調(diào)；而轉(zhuǎn)染pcDNA3-IRF3后，與pcDNA3空載體對照組和正常組相比，IRF3蛋白和基因表達(dá)量都顯著增加(F=21.303，P<0.01;F=18.358，P<0.01)，說明轉(zhuǎn)染效果較好。而炎癥因子TNF-α的蛋白和基因表達(dá)量與pcDNA3空載體對照組比較，則明顯受到抑制(F=24.255，P<0.01;F=188.028，P<0.01)，另一炎癥指標(biāo)因子IL-6在蛋白和基因水平上也表現(xiàn)出相同的趨勢(F=54.689，P<0.01;F=107.817，P<0.01),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明在LPS誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中IRF3抑制炎癥因子的釋放。

圖3 過表達(dá)IRF3后IL-6及TNF-α的蛋白表達(dá)

1:正常組；2：LPS刺激組；3：LPS刺激組+轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3對照組；4：LPS刺激組+轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3-IRF3組；與正常組比較：**P<0.01；與pcDNA3空載體對照組比較：##P<0.01

圖4 過表達(dá)IRF3后IL-6及TNF-α的mRNA表達(dá)

1:正常組; 2：LPS刺激組;3：LPS刺激組+轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3對照組; 4：LPS刺激組+轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3-IRF3組；與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01；與pcDNA3空載體對照組比較：##P<0.01

圖5 ELISA檢測過表達(dá)IRF3后細(xì)胞分泌的IL-6及TNF-α蛋白表達(dá)

1：正常組；2：LPS刺激組；3：LPS刺激組+轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3對照組；4：LPS刺激組+轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3-IRF3組；與正常組比較：**P<0.01；與pcDNA3空載體對照組比較：##P<0.01

2.3IRF3對NF-κB信號通路的影響Western blot方法表明，LX-2細(xì)胞在LPS刺激后12 h后，與正常組比較，p-p65及p-IκBα表達(dá)量明顯升高，提示NF-κB信號通路激活。而與pcDNA3空載體對照組比較，過表達(dá)IRF3后，p-IκBα及p-p65蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(F=131.045,P<0.01;F=122.267,P<0.01)，而非磷酸化的IκBα和p65蛋白水平未見顯著改變(F=1.317,P>0.05;F=0.043,P>0.05)，表明IRF3抑制NF-κB信號通路的激活。見圖6。

圖6 IRF3對NF-κB信號通路的影響

1:正常組；2：LPS刺激組；3：LPS刺激組+轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3對照組；4：LPS刺激組+轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3-IRF3對照組；與正常組比較：**P<0.01；與pcDNA3空載體對照組比較：##P<0.01

3 討論

在哺乳動物中，目前已知的干擾素轉(zhuǎn)錄因子家族共包含9個成員，分別命名為IRF1～9，其中IRF3廣泛表達(dá)于個體各種組織及細(xì)胞中，在合成I型干擾素及其誘導(dǎo)基因的生化過程中起著關(guān)鍵作用[6]。IRF3除了在免疫系統(tǒng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用外，近年來研究[9]報道，IRF3在脂質(zhì)代謝、急性肝損傷、腫瘤等也起著顯著的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)研究了IRF3在星狀細(xì)胞中對炎癥因子分泌的影響。

脂多糖LPS是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分，是革蘭陰性菌致病的主要因素，可以引起機(jī)體一系列的炎癥反應(yīng)[10]，在本實(shí)驗(yàn)中用濃度為2 μg/ml 的LPS誘導(dǎo)激活LX-2細(xì)胞。

研究[11]表明，NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控，介導(dǎo)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB二聚體通過非共價鍵的形式與其抑制蛋白IκB結(jié)合而分散在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在內(nèi)的許多因素可激活NF-κB，激活后的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA模塊上的特異蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)特異mRNA的產(chǎn)生，最后轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生和釋放各種細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)用LPS誘導(dǎo)激活細(xì)胞，再通過瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3-IRF3過量表達(dá)IRF3，觀測其對NF-κB信號通路的影響，結(jié)果顯示NF-κB信號通路中的關(guān)鍵蛋白p-p65及P-IκBα表達(dá)量與pcDNA3空載體對照組相比明顯減少，而p65和p-IκB表達(dá)量未見改變，提示IRF3可能是通過抑制NF-κB從而減少炎癥因子的釋放。IRF3在LPS誘導(dǎo)的星狀細(xì)胞中能夠抑制炎癥因子的分泌，說明IRF3可能參與了肝臟炎癥和纖維化的病理過程，但由于肝纖維化發(fā)生發(fā)展的病理因素復(fù)雜，IRF3在纖維化中扮演的角色需要進(jìn)一步的探究。