張勇，左朋，周美琪，王晶，李福森，劉春明

（長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130032）

桑黃是一種珍貴的真菌，在我國(guó)分布比較廣泛，主要生長(zhǎng)在桑樹(shù)、楊樹(shù)等闊葉樹(shù)的樹(shù)干上[1-2]。桑黃中含有多種化學(xué)成分，其中，多糖、黃酮、三萜和酚類物質(zhì)為主要的活性成分。桑黃在抗癌、降血糖、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、消炎止痛、血管疾病等方面有良好的藥理作用，近年來(lái)桑黃在抗癌及免疫調(diào)節(jié)方面受到了廣泛的關(guān)注[3-5]。由于我國(guó)天然桑黃數(shù)量稀少，近年來(lái)開(kāi)采較多，造成了桑黃野生資源的數(shù)量銳減。因此，人工培養(yǎng)桑黃蓬勃發(fā)展起來(lái)，但是人工培養(yǎng)桑黃的品質(zhì)及化學(xué)成分與野生的相比有較大差異，桑黃有效成分含量差異也較大，故有必要對(duì)桑黃的質(zhì)量進(jìn)行合理的控制，通過(guò)試驗(yàn)找出適合桑黃培育的環(huán)境、培育優(yōu)質(zhì)人工桑黃的方法，為桑黃的研發(fā)提供基本保障[6-8]。目前，我國(guó)對(duì)桑黃的研究主要集中在對(duì)其化學(xué)成分和生物學(xué)特征以及藥理方面的研究，但對(duì)桑黃中單體化學(xué)成分的含量分析的報(bào)道較少。

近十年來(lái)，高效液相色譜法廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物、醫(yī)藥和化工等科學(xué)領(lǐng)域，特別是在天然產(chǎn)物的分析和分離上應(yīng)用廣泛[9-10]。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）具有高效、高靈敏度、速度快的特點(diǎn)，對(duì)桑黃進(jìn)行檢測(cè)分析，根據(jù)高效液相色譜圖可以通過(guò)峰形、峰面積以及出峰時(shí)間直觀地比較不同來(lái)源桑黃中活性成分的區(qū)別[11-12]，對(duì)比不同地區(qū)不同生長(zhǎng)條件下的桑黃中單體化學(xué)成分的含量，為桑黃的質(zhì)量控制提供一定的試驗(yàn)依據(jù)[13-14]。

davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 為桑黃中含量較高的3種化合物[15]，見(jiàn)圖1。從結(jié)構(gòu)上看，其屬于典型的多酚類成分，經(jīng)研究證實(shí)具有多種藥效作用，該文選取了多種不同來(lái)源的桑黃，包括不同生長(zhǎng)年份的野生桑黃以及人工栽培的桑黃，考察不同桑黃提取物中3種化合物的含量，為桑黃資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

圖1 3種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of the three compounds

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃A：杭州千島湖桑之寶農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司；桑黃B：金寨縣永福桑黃菌種植專業(yè)合作社；桑黃C：山東黃河林道千年古桑林菇園桑黃研究所；桑黃D和桑黃E：浙江桑之路桑黃有限公司；野生桑黃F（約3年）：山東省菇園食用菌科技有限公司；野生桑黃H（約10年）、野生桑黃K（5年以上）：吉林延邊華廈有限公司；桑黃G（約3年）和桑黃I（約2年）：通化十月細(xì)潤(rùn)生物科技有限公司；桑黃J：安徽藍(lán)溪生物科技有限公司，桑黃菌種資源為桑黃纖孔菌Inonotus sanghuang。

甲醇、醋酸（色譜純?cè)噭杭幽么驝aledon Laboratories Ltd.公司；davallialactone、hypholomine B、inoscavin A（純度≥95%）：長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室自制；其它試劑（均分析純）：北京精細(xì)化學(xué)品有限公司。

Thermo U3000高效液相色譜儀、配備DAD檢測(cè)器：美國(guó)賽默有限公司；Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)Heidolph公司；FA1204A電子分析天平：德國(guó)桑塔瑞斯公司；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；YoungLin Istrument超純水制備器：韓國(guó)Younglin Istrument公司；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

精密稱取桑黃粉末（A：1.000 0 g、B：1.000 2 g、C：1.000 3 g、D：1.000 5 g、E：1.000 3 g、F：1.000 2 g、G：1.000 8 g、H：1.000 5 g、I：1.000 6 g、J：1.000 9 g、K：1.000 2 g），25 mL部80%乙醇為溶劑進(jìn)行超聲輔助提取，時(shí)間為60 min，溫度為45℃，抽濾，減壓回收，去除殘?jiān)V甲醇定容至10 mL的容量瓶中，得到桑黃粗提物，4℃冰箱保存，待用，HPLC檢測(cè)前過(guò)0.45 μm 濾膜。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 0.500 2、0.500 5、0.500 8 mg，色譜甲醇制成濃度為500 μg/mL的貯備液，過(guò)0.45 μm的濾膜，制得對(duì)照品溶液。

1.2.3 液相色譜條件

HPLC的分析條件：流動(dòng)相為乙腈（A）和0.2%醋酸水溶液（B）；色譜柱為 Thermo U3000 C18（250 mm×4.6 mm，5 mm）。柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：395 nm；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。洗脫梯度如表1所示。在此條件下，對(duì) davallialactone、hypholomine B、inoscavin A標(biāo)準(zhǔn)溶液及不同桑黃提取物進(jìn)行HPLC分析。

表1 HPLC洗脫梯度Table 1 HPLC elution gradient

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系與范圍

將 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 溶液濃度稀釋為 2.5、4、5、7.5、10 μg/mL，依次進(jìn)入高效液相色譜中相同條件進(jìn)行檢測(cè)，得到色譜圖。分別以質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（y，mAU）為縱坐標(biāo)制作 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 3種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of the three compounds

3種化合物的線性回歸方程分別為：y=8.856 7x+0.171 4、y=100.63x+75.786、y=7.493 8x-13.284，相關(guān)系數(shù)分別為 r=0.998 9、0.998 1、0.999 9，結(jié)果表明，在 2.5 μg/mL～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn)

按照“1.2.2”對(duì)照品溶液和“1.2.3”的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定色譜峰面積，以峰面積考察精密度，davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standrd deviation，RSD）分別為0.49%、0.57%、0.75%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取桑黃H同一樣品溶液，分別于制備后的0、2、8、12、18、24 h，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行 HPLC 測(cè)定，桑黃樣品中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為 0.67%、0.66%、0.73%，表明樣品在24 h以內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批桑黃H藥材各5份，以乙醇為溶劑，超聲提取物法制備樣品溶液，分別應(yīng)用于HPLC進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，桑黃中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A的平均含量分別為2.95%、1.21%、1.39%，峰面積含量的RSD分別為0.62%、0.58%、0.41%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.3 不同桑黃提取物中3種化合物的含量評(píng)價(jià)

為了高效率地對(duì)樣品中有效成分進(jìn)行提取，以乙醇為溶劑，采用超聲提取法對(duì)桑黃中目標(biāo)成分進(jìn)行提取，將處理好的桑黃樣品按照1.2.3中液相色譜條件進(jìn)行分析。在測(cè)試過(guò)程中，分別考察以甲醇和乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相，甲醇作為洗脫溶劑時(shí)色譜系統(tǒng)壓力較乙腈大，并且峰形較寬，洗脫時(shí)間也會(huì)相對(duì)較長(zhǎng)，因此，選用乙腈作為洗脫的流動(dòng)相。通過(guò)試驗(yàn)表明向水相中加入一定量的醋酸，能有效防止分子在水相和有機(jī)相中電離，有利于改善樣品的色譜峰形狀和基線，避免出現(xiàn)拖尾和基線漂移[16-17]。因此，選用了乙腈-0.2%醋酸水溶液作為流動(dòng)相對(duì)桑黃樣品進(jìn)行梯度洗脫。

HPLC檢測(cè)11種不同的桑黃提取物的結(jié)果見(jiàn)圖3。

如圖3所示，在選定的條件下，桑黃中各主要成分得到較好的分離，目標(biāo)成分davallialactone、hypholomine B、inoscavin A和其他化合物的色譜峰在譜圖中基本得到基線分離，該方法可以用于桑黃中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的定量分析[18]。

圖3 11種不同來(lái)源桑黃提取物的液相色譜圖Fig.3 HPLC of 11 extracts from different sources of Phellinus igniarius

根據(jù)圖3所示，3種化合物色譜峰保留時(shí)間與桑黃提取物樣品中化合物色譜峰保留時(shí)間基本一致，不同桑黃提取物中大部分峰為共有峰，這說(shuō)明提取物中含有的組分較為相似，而不同提取物中色譜峰高、峰面積有所區(qū)別，則說(shuō)明在不同桑黃提取物中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的含量有一定差異。其中，C、D、I桑黃樣品中目標(biāo)化合物色譜峰較其它樣品差異較大，樣品中davallialactone峰較高，而之后基本未出峰，說(shuō)明該樣品中未檢測(cè)到hypholomine B和inoscavin A。

2.4 11種不同來(lái)源桑黃中3種化合物的含量比較

應(yīng)用HPLC法對(duì)11種桑黃提取物中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表2數(shù)據(jù)表明，在11種桑黃樣品中，野生桑黃提取物中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量高于人工栽培桑黃。其中C、D、J桑黃樣品（均為人工栽培）中未檢測(cè)到hypholomine B、inoscavin A，I桑黃樣品中未檢測(cè)到hypholomine B。桑黃H和F樣品中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 含量最高，基本上達(dá)到了1%以上，桑黃A、桑黃K、桑黃E和桑黃 B 樣品中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量次之，達(dá)到了0.2%～0.6%之間，而桑黃C、桑黃D、桑黃I、桑黃G和桑黃L樣品中davallialactone、inoscavin A含量相對(duì)較少，在0.1%～0.2%之間，未檢測(cè)到hypholomine B。

表2 11種不同產(chǎn)地davallialactone、hypholomine B、inoscavin A的含量Table 2 Contents of davallialactone，hypholomine B and inoscavin A in Phellinus igniarius of 11 species from different habitats

對(duì)比人工栽培桑黃C、桑黃D和桑黃I，未檢出hypholomine B、inoscavin A，差異的結(jié)果可能與栽培過(guò)程中的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組成有關(guān)；而桑黃A、桑黃B桑黃E、桑黃G和桑黃J中，3種單體化合物的含量相差很大，可能是與人工栽培生長(zhǎng)年份、生長(zhǎng)環(huán)境等不同因素有關(guān)。

對(duì)比野生桑黃，桑黃K（約5年以上）、桑黃H（約10年） 和桑黃 F（約 3年） 中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量，桑黃H中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量最高，而桑黃K中3種單體化合物的含量較低，初步判斷可能是與生長(zhǎng)年份有關(guān)，生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)有利于3種單體化合物的累積，也可能與子實(shí)體生長(zhǎng)的樹(shù)種有關(guān)。

3 結(jié)論

近年來(lái)，桑黃因其廣泛而優(yōu)異的藥理活性，受到廣泛關(guān)注。由于大量的采摘，致使我國(guó)野生桑黃數(shù)量稀少，因此培育優(yōu)質(zhì)桑黃快速發(fā)展，但人工栽培桑黃與野生桑黃中有效成分含量差距較大。本研究應(yīng)用HPLC法評(píng)價(jià)不同桑黃提取物中的davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量，該方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、靈敏度高和重復(fù)性良好。通過(guò)對(duì)比這11種不同來(lái)源的桑黃樣品中3種含量較高的有效成分含量發(fā)現(xiàn)，桑黃中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量與桑黃生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)年份以及培育方式有關(guān)，該研究為桑黃的質(zhì)量控制及相關(guān)藥物研發(fā)提供一定試驗(yàn)依據(jù)。