張 娟，母 童，趙 平，陳佳萍，馮小芳，郭 鵬，武澤文，劉麗元，蔣秋斐，顧亞玲，*

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021； 2.彭陽(yáng)縣畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏 固原 756500)

靜原雞又名固原雞、靜寧雞，主要分布于寧夏南部地區(qū)，是國(guó)家畜禽資源保護(hù)品種之一，現(xiàn)以彭陽(yáng)縣數(shù)量最多，質(zhì)量最優(yōu)。彭陽(yáng)縣地屬溫帶半干旱大陸季風(fēng)性氣候，因此靜原雞兼顧耐干旱、易放牧、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且肉質(zhì)鮮美、細(xì)嫩，氨基酸、脂肪酸含量高、膽固醇含量低，是雞肉中首選的綠色營(yíng)養(yǎng)保健食品[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的人開始關(guān)注膳食營(yíng)養(yǎng)，對(duì)肉品質(zhì)的要求更是如此。脂肪酸含量是肉品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，有研究表明，雞肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味與脂肪酸的組成和含量密切相關(guān)[2]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，靜原雞中含有豐富且對(duì)人體有特殊營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)[3]。極長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶蛋白家族(elongation of very-long-chain fatty acids，ELOVLs)最早來(lái)源于酵母ELO家族(ELO1、ELO2、ELO3)，是長(zhǎng)鏈脂肪酸(C16、C18)和超長(zhǎng)鏈脂肪酸(≥C20)合成的起始酶和限速酶[4]。直至目前，共發(fā)現(xiàn)7種蛋白家族成員(ELOVL1-7)，分別參與延長(zhǎng)不同長(zhǎng)度的脂肪酸鏈，對(duì)脂肪酸的代謝進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能[5]。ELOVL5基因全長(zhǎng)897 bp，定位于人體6號(hào)染色體，共編碼299個(gè)氨基酸，主要參與單不飽和脂肪酸(C16、C18)和多不飽和脂肪酸(C18、C20、C22)的合成[6-7]，并且調(diào)控肝臟、脂肪及碳水化合物的代謝，從而影響血脂、血糖濃度[8]。ELOVL5基因在靜原雞肝臟中的表達(dá)量最高，其他部位也均有表達(dá)，其編碼的脂肪酸還與人體糖尿病、眼病、炎癥性腸疾病及許多其他疾病有關(guān)[9-11]。Matsumoto等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ELOVL5基因與肉牛背膘厚存在顯著相關(guān)。郭鵬程等[13]研究表明，ELOVL5基因啟動(dòng)子序列SNP7(g.-385C>G)中GG基因型、GA基因型與尿素氮、校正奶量顯著相關(guān)。目前，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究報(bào)道都集中在魚類及ELOVLs家族與人類眾多疾病之間的關(guān)系研究[14-18]，在雞上的報(bào)道極少。

本研究以寧夏地方優(yōu)良品種靜原雞為研究對(duì)象，利用PCR-SSCP及DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)靜原雞ELOVL5基因遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，為后期挖掘與肉質(zhì)相關(guān)的位點(diǎn)提供基礎(chǔ)資料，并為我國(guó)地方品種雞的種質(zhì)資源遺傳評(píng)定及地方品種分子育種的技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

隨機(jī)選取彭陽(yáng)縣朝那雞繁育中心第五世代150日齡靜原雞248只，采用一次性真空采血管翼下靜脈采血3～5 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 設(shè)備

B-120自動(dòng)顆粒制冰機(jī)購(gòu)自太倉(cāng)市華美生化儀器廠；電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多中國(guó)地區(qū)；PCR儀、微量移液槍、低溫高速冷凍離心機(jī)均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；WD-9406型膠片觀察燈、DYY-6C型電泳儀均購(gòu)自北京市六一儀器；凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)購(gòu)自時(shí)代聯(lián)想生物科技有限公司；微波爐購(gòu)自格蘭仕微波爐電器有限公司等。

1.1.3 試劑

Tris-平衡酚，蛋白酶K，6×loading buffer，瓊脂糖，1×TAE均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；2×PowerTaqPCR MasterMix，DL2000 DNA Marker均購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；丙烯酰胺(Acr)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)、去離子甲酰胺均購(gòu)自Ameresco公司；Tris購(gòu)自MP生物醫(yī)療公司；四甲基乙二胺(TEMED)、無(wú)水乙醇均購(gòu)自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及檢測(cè)

采用苯酚氯仿抽提法提取雞血液中的基因組DNA，用TE緩沖液溶解。將提取出來(lái)的DNA通過0.8%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)并拍照保存。合格DNA樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)NCBI上提供的原雞ELOVL5(登錄號(hào)：NC_006090.4)基因序列，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(引物序列見表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20.0 μL：滅菌超純水7.4 μL，模板0.8 μL(50～100 ng·μL-1)，上下游引物各0.4 μL(10 pmol·L-1)，2×PowerTaqPCR Master Mix 11.0 μL(5 U·μL-1)。靜原雞ELOVL5基因exon2、intron2和exon5 PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，退火溫度見表1，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：取3.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，上樣于1%瓊脂糖凝膠，以DL 2 000 DNA Marker作為對(duì)照，100 V電壓15 min，凝膠成像儀觀察檢測(cè)結(jié)果。

表1ELOVL5基因引物及擴(kuò)增區(qū)域

Table1The primer and amplified region forELOVL5 gene

基因Gene擴(kuò)增區(qū)域Amplified regions引物序列Primer sequences(5′-3′)退火溫度Tm/℃產(chǎn)物長(zhǎng)度Product length/bpELOVL5Exon2F: GAGTATCTGTCTGCAATTTTTGT50.3262R: TTTCTTATGCTCTAGTGTGTGTTIntron2F: TTGAAGGTCATCAAGTCGAACTGCA59.7304R: GCAAATCTGTTTATCAAGGGCTACGExon5F: TGTGGGAAGGTGTGGTGATGA56.9350R: GGCCTCTGATGCAAGCATATC

1.2.4 PCR-SSCP檢測(cè)

取2.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入8.0 μL變性緩沖液，含980 μL去離子甲酰胺，20 μL 0.5 mol·L-1EDTA，少量溴酚藍(lán)和二甲苯青藍(lán)(一般7～8 μL)，混勻，98 ℃變性10 min，冰浴10 min。將變性后的PCR產(chǎn)物，上樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=29∶1)，電泳條件見表2。

1.2.5 產(chǎn)物測(cè)序

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分型，挑取不同帶型對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物送去生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)，找出突變位點(diǎn)。運(yùn)用Popgen軟件計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和卡方值，利用PIC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

靜原雞全基因組DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖1所示，其條帶清晰明亮，無(wú)拖帶。通過紫外分光光度計(jì)測(cè)其D260/D280為1.6～1.8，無(wú)DNA降解，沒有蛋白、外源核酸及其他雜質(zhì)污染，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后3對(duì)引物分別得到1條清晰且單一、與目的片段大小一致的片段，且無(wú)引物二聚體及非特異性條帶，可進(jìn)行后續(xù)SSCP分析，結(jié)果見圖2。

表2ELOVL5基因PCR-SSCP電泳條件

Table2Electrophoresis conditions of PCR-SSCP forELOVL5 gene

基因Gene擴(kuò)增區(qū)域Amplified regions預(yù)電泳Pre-electrophoresis高電壓High voltage電泳ElectrophoresisELOVL5Exon2250 V, 30 min250 V, 10 min100 V, 11 hIntron2250 V, 30 min250 V, 10 min100 V, 14 hExon5250 V, 30 min250 V, 10 min100 V, 20 h

1～9，不同個(gè)體的DNA樣。1-9, DNA samples from different individuals.圖1 靜原雞全基因組DNA提取Fig.1 The genomic DNA extraction of Jingyuan chicken

2.3 PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果

如圖3所示，將3對(duì)引物對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行SSCP檢測(cè)，結(jié)果在ELOVL5基因 exon2和exon5擴(kuò)增片段上分別檢測(cè)出一種帶型。在ELOVL5基因intron2擴(kuò)增片段上共檢測(cè)到2種帶型，分別為AA和AG。隨機(jī)取不同帶型的2個(gè)PCR產(chǎn)物回收純化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

M， DL2000 DNA marker；1～18， 不同個(gè)體的PCR樣品。M, DL2000 DNA marker; 1-18, PCR samples from different individuals.圖2 ELOVL5基因各位點(diǎn)PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection of PCR products in ELOVL5 gene

圖3 ELOVL5基因各位點(diǎn)SSCP檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection of SSCP in ELOVL5 gene

2.4 等位基因序列比對(duì)分析

與NCBI公布的原雞ELOVL5基因序列(NC_006090.4)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)靜原雞ELOVL5基因exon2和exon5引物擴(kuò)增片段均無(wú)多態(tài)性，基因序列與原序列均一致，結(jié)果如圖4、圖5所示。靜原雞ELOVL5基因intron2引物擴(kuò)增片段多態(tài)性是由內(nèi)含子區(qū)的核苷酸點(diǎn)突變?cè)斐傻模任换蛐蛄斜葘?duì)如圖6，其中等位基因A存在g.88620433+1683G>A的轉(zhuǎn)換。

圖4 ELOVL5基因exon2 等位基因序列比對(duì)Fig.4 The alleles sequence alignment of ELOVL5 gene exon2

圖5 ELOVL5基因exon5等位基因序列比對(duì)Fig.5 The alleles sequence alignment of ELOVL5 gene exon5

圖6 ELOVL5基因intron2等位基因序列比對(duì)Fig.6 The alleles sequence alignment of ELOVL5 gene intron2

2.5 ELOVL5基因SNPs位點(diǎn)遺傳特性分析

ELOVL5基因intron2遺傳多態(tài)性分析見表3和表4。在靜原雞ELOVL5基因intron2中基因A為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率為0.92。基因型AA為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.84。在248個(gè)靜原雞群體中沒有發(fā)現(xiàn)含純合GG型的個(gè)體。群體遺傳學(xué)分析表明：該位點(diǎn)純合度較高，為0.84，PIC為0.14(PIC<0.25)，呈低度多態(tài)?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，靜原雞ELOVL5基因intron2突變未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表3ELOVL5基因內(nèi)含子2等位基因頻率和基因型頻率

Table3Allele frequency and genotype frequency ofELOVL5 gene intron 2

基因型個(gè)數(shù)頻率等位基因頻率GenotypeNumberFrequencyAlleleFrequencyAA2080.84A0.92AG400.16G0.08

表4ELOVL5基因內(nèi)含子2遺傳多態(tài)性參數(shù)

Table4Genetic polymorphism parameters ofELOVL5 gene intron 2

多態(tài)性位點(diǎn)遺傳多態(tài)性參數(shù)靜原雞PolymorphismGenetic polymorphism parametersJingyuan chickenELOVL5基因第2內(nèi)含子純合度Homozygosity(Ho)0.84ELOVL5 intron2雜合度Heterozygosity(He)0.16有效等位基因Effective number of alleles(Ne)1.17多態(tài)信息含量Polymorphism information content(PIC)0.14卡方值Chi-Square(X2)1.86

3 討論

生物體遺傳多樣性主要由于其生存環(huán)境及病原體壓力驅(qū)動(dòng)導(dǎo)致基因水平上的差異所致[19]。Matsumoto等[12]研究表明ELOVL5基因g.-110T>C是肉牛育種一個(gè)有用的遺傳標(biāo)記。ELOVL5基因intron5多態(tài)性還與鯉魚體重增加顯著相關(guān)，可以將EOLVL5延伸酶基因可作為鯉魚分子育種的候選基因[20]。Shi等[21]在山羊乳腺上皮細(xì)胞中通過下調(diào)或過表達(dá)ELOVL5基因，三酰甘油的含量不會(huì)改變，突出了ELOVL5基因在反芻動(dòng)物乳腺中16C和18C不飽和脂肪酸延伸中的重要作用。ELOVL5基因還參與蛋雞中N-3和N-6長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的生物合成[22]。本研究運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)靜原雞ELOVL5基因的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ELOVL5基因exon2和exon5擴(kuò)增片段均未發(fā)生堿基突變，無(wú)多態(tài)性，表明靜原雞ELOVL5基因exon2和exon5的遺傳性狀比較穩(wěn)定，也可能由于此區(qū)域曾發(fā)生過變異，但由于該個(gè)體對(duì)當(dāng)時(shí)的環(huán)境不夠適應(yīng)以及自身抗病、耐寒等方面存在缺陷，而逐漸被自然或人為淘汰。同樣，母童等[3]在靜原雞ELOVL2基因exon6擴(kuò)增片段上也未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，說明靜原雞在遺傳進(jìn)化上趨于穩(wěn)定。與原雞ELOVL5基因序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)在靜原雞ELOVL5基因intron2擴(kuò)增片段上僅存在g.88620433+1683G>A的轉(zhuǎn)換，該位點(diǎn)的突變可能在靜原雞肉質(zhì)方面及抗旱耐寒等優(yōu)良性狀的基因表達(dá)調(diào)控方面具有一定作用，具體機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

動(dòng)物群體內(nèi)的個(gè)體間差異主要與遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)等有關(guān)，遺傳變異越大，選擇的潛力就越大。在靜原雞ELOVL5基因intron2擴(kuò)增片段上共檢測(cè)到2種基因型，分別為AA、AG，純和度(0.84)遠(yuǎn)高于雜合度(0.16)，表現(xiàn)純合子優(yōu)勢(shì)，因此在環(huán)境中的表現(xiàn)型趨于穩(wěn)定。本研究248個(gè)靜原雞群體中沒有發(fā)現(xiàn)含純合GG型的個(gè)體，可能由于長(zhǎng)期的自然選擇而被淘汰。靜原雞的PIC值為0.14(PIC<0.25)，屬低度多態(tài)?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明靜原雞ELOVL5基因intron2突變未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，說明這個(gè)位點(diǎn)保守性較高，可能受當(dāng)?shù)厝罕婇L(zhǎng)期人工選育的影響。