張春嶺，劉 慧，劉杰超，陳大磊，焦中高

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州 450009)

近年來，隨著人們對(duì)健康飲食的關(guān)注，滿足不同消費(fèi)人群的紅棗加工新產(chǎn)品開發(fā)需求逐漸提升。乳酸發(fā)酵的代謝產(chǎn)物可增強(qiáng)人體免疫力，現(xiàn)階段，牛奶乳酸飲料已形成市場(chǎng)規(guī)模，發(fā)展果蔬乳酸發(fā)酵制品是水果加工產(chǎn)業(yè)今后的研究熱點(diǎn)。根據(jù)紅棗含糖量高的特點(diǎn)，利用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，使一部分糖轉(zhuǎn)化為乳酸，通過代謝產(chǎn)物之間的協(xié)同作用，使產(chǎn)品風(fēng)味濃郁柔和，具有典型的發(fā)酵香氣和棗香氣，而且可以較好地保持紅棗原有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和功能性成分[1-2]。本文以總酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和乳酸菌接種量等發(fā)酵條件對(duì)紅棗乳酸飲料的影響，通過響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)分析了發(fā)酵前后產(chǎn)品中功能性成分的變化情況，以期為高營(yíng)養(yǎng)、功能性紅棗乳酸發(fā)酵飲料的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗，市售優(yōu)質(zhì)新疆灰棗；乳酸菌，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；FD試劑，美國(guó)Sigma公司；MRS，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-DJ超凈工作臺(tái)，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；FE 20 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海有限公司；TGL-16G-A 臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Specord 50紫外可見分光光度計(jì)，德國(guó)Analytic Jena公司。

1.3 方法

1.3.1紅棗漿的制備 選取無病蟲害的優(yōu)質(zhì)紅棗，用清水清洗干凈，然后浸泡3～4h，復(fù)水飽滿為止，依據(jù)前期試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果，以料水比1∶8的比例加水煮沸，去核、打漿、過濾，得到固形物15%的棗漿。

1.3.2發(fā)酵劑的制備 菌種活化：采用脫脂奶粉加入5～7倍熱水溶解，分裝在洗凈的試管中115℃、15min滅菌制成培養(yǎng)基，冷卻至室溫，將菌種接入液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6h。擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化菌種接種于已滅菌的棗漿奶培養(yǎng)液中，42℃培養(yǎng)3h，放入冰箱備用。

1.3.3調(diào)配、均質(zhì) 依據(jù)前期試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果，將脫脂乳和乳糖分別按照7.5%和3%的比例加入棗漿中攪拌均勻，然后進(jìn)行均質(zhì)處理。

1.3.4接種、發(fā)酵、取樣 把均質(zhì)好的棗漿進(jìn)行巴氏殺菌，然后冷卻至室溫，按照不同接種量接入乳酸發(fā)酵劑，在一定溫度下恒溫發(fā)酵，每隔一定時(shí)間取樣，迅速移至冰箱中冷藏待測(cè)。

1.3.5紅棗乳酸發(fā)酵單因素試驗(yàn) (1)發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵的影響：固定發(fā)酵溫度為40℃、乳酸菌接種量9%，考察不同發(fā)酵時(shí)間12、18、24、30、36、44h對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵的影響。(2)發(fā)酵溫度對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵的影響：固定發(fā)酵時(shí)間為24h、乳酸菌接種量9%，考察不同發(fā)酵溫度30、35、40、45、50℃對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵的影響。(3)乳酸菌接種量對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵的影響：固定發(fā)酵時(shí)間為24h、發(fā)酵溫度40℃，考察不同乳酸菌接種量3%、5%、7%、9%、11%對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵的影響。

1.3.6紅棗乳酸發(fā)酵工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量3個(gè)因素，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件，根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)三因素三水平(共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)4 個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面試驗(yàn)(表1)，以紅棗乳酸發(fā)酵飲料中的總酸含量為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料工藝進(jìn)行優(yōu)化[3]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.7類黃酮和總酚含量的測(cè)定

(1)提取液的制備：取2.0g樣品于離心管中，加入4mL 80%的甲醇，30℃超聲提取30min，然后9 000r/min離心10min，收集上清液，殘?jiān)眉状既芤褐貜?fù)提取2次，合并上清液，定容后于-80℃冰箱中保存，用于類黃酮和總酚的測(cè)定。(2)類黃酮含量的測(cè)定：硝酸鋁比色法[4]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。(3)總酚含量的測(cè)定：Folin-Ciocalteus法[5]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.8總酸的測(cè)定 參照GB/T 12456-2008 食品中總酸的測(cè)定方法，以乳酸計(jì)。

1.3.9還原糖的測(cè)定 參照GB/T 5009.7-2008 食品中還原糖的測(cè)定方法。

1.3.10pH的測(cè)定 用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.11菌落總數(shù)的測(cè)定 采用MRS培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法[1]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Design-expert 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料總酸含量的影響 由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中總酸含量先升高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到24h時(shí)，總酸含量最高，然后總酸含量基本趨于穩(wěn)定?？赡苁怯捎谇捌谌樗峋玫孜锓敝?，產(chǎn)酸率較快，而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，一部分乳酸菌衰老死亡，另外隨著產(chǎn)酸量的升高，乳酸菌也會(huì)受到不同程度的抑制而使產(chǎn)酸量下降，總酸含量基本不再改變[6]。在試驗(yàn)條件下，發(fā)酵時(shí)間以24h為宜。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料總酸含量的影響

2.1.2發(fā)酵溫度對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料總酸含量的影響 由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，樣品中總酸含量先升高后降低。乳酸菌的活性和溫度密切相關(guān)。發(fā)酵溫度過低，乳酸菌繁殖緩慢，產(chǎn)酸量低；發(fā)酵溫度過高，乳酸菌繁殖迅速，代謝旺盛，甚至使乳酸菌死亡而影響產(chǎn)酸量[7-8]。因此，發(fā)酵溫度以40℃為宜。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料總酸含量的影響

2.1.3接種量對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料總酸含量的影響 由圖3可知，樣品中總酸含量隨著接種量的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。這是由于接種量較低時(shí)，乳酸菌繁殖基數(shù)少，活菌數(shù)增加相對(duì)較慢；接種量過大，會(huì)導(dǎo)致底物消耗過快，產(chǎn)酸過快以及乳酸菌代謝產(chǎn)物的增加都會(huì)抑制乳酸菌的活性[9-10]，只有適宜的接種量才能使乳酸菌的繁殖和產(chǎn)酸能力達(dá)到最佳。本試驗(yàn)確定接種量以9%為宜。

圖3 接種量對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料總酸含量的影響

2.2 紅棗乳酸發(fā)酵工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面多元回歸模型的建立與分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(表2)。采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到紅棗乳酸發(fā)酵飲料中總酸含量的二次回歸方程為：Y=0.90+0.031A+0.021B+0.041C+4.5*10-4AB-0.014AC-0.039A2-0.050B2-0.052C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2各因素間交互作用響應(yīng)面分析 圖4是通過上述多元二次回歸模型所得到的響應(yīng)面圖，可用于評(píng)價(jià)當(dāng)發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間任意一個(gè)因素位于中心水平時(shí)，其余兩個(gè)因素間的交互作用及對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料產(chǎn)酸量的影響[12]。由圖4c可以看出，發(fā)酵溫度(A)與接種量(C)之間的交互作用對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料中的總酸含量影響較大，表現(xiàn)為曲面較陡峭，其他各因素間交互作用的影響較小。同時(shí)由表3方差分析結(jié)果顯示，發(fā)酵溫度(A)與接種量(C)之間的交互作用對(duì)產(chǎn)酸量具有極顯著影響(P<0.01)，而其他各因素間交互作用的影響不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)條件下，各因素間交互作用對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料中總酸含量的影響大小依次為AC>AB>BC。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

注：* *差異極顯著，P<0.01；*差異顯著，P<0.05

2.2.3最佳工藝條件預(yù)測(cè)與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)回歸模型，預(yù)測(cè)得到紅棗乳酸發(fā)酵在穩(wěn)定狀態(tài)下的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度42.81℃、發(fā)酵時(shí)間24.18h、接種量9.64%。在此條件下，制備得到的紅棗乳酸發(fā)酵飲料中的總酸含量理論上可以達(dá)到0.907g/100g。考慮到實(shí)際操作的可行性，將工藝條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為發(fā)酵溫度43℃、發(fā)酵時(shí)間24 h、接種量10%。采用此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的紅棗乳酸發(fā)酵飲料中的總酸含量平均值為0.897g/100g，基本與預(yù)測(cè)值相符，說明優(yōu)化結(jié)果可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。由表4可以看出，發(fā)酵前后pH和還原糖含量下降，總酸和活菌數(shù)升高，而黃酮和總酚含量可能由于發(fā)生氧化有所降低[13]，但是差異不明顯，說明在此發(fā)酵條件下紅棗乳酸發(fā)酵飲料中的活性成分得到了很好地保留。

圖4 各因素交互作用響應(yīng)面圖

表4 乳酸發(fā)酵前后棗漿中活性物質(zhì)含量的變化

注：同列均值有共同字母表示差異不顯著，P>0.05；無共同字母表示差異顯著，P<0.05

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)紅棗乳酸發(fā)酵飲料的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵溫度43℃、發(fā)酵時(shí)間24h、接種量10%，在此條件下，紅棗乳酸發(fā)酵飲料中的總酸含量可以達(dá)到0.897g/100g，黃酮和總酚的含量與發(fā)酵前相比無顯著差異，活菌數(shù)4.2×107cfu/mL，紅棗乳酸發(fā)酵飲料中的活性成分得到了很好地保留，得到的回歸模型對(duì)試驗(yàn)擬合較好，為紅棗乳酸發(fā)酵飲料的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)?！?/p>