吳侃 王洪陽 楊駒 趙翠 蘭蘭 王大勇 關(guān)靜 王秋菊

解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科解放軍耳鼻咽喉研究所(北京100853)

耳聾是人類最常見的感覺功能障礙性疾病，大約三分之二的耳聾與遺傳因素相關(guān)[1]。遺傳性耳聾有著顯著的遺傳異質(zhì)性和表型多樣性，同一基因的變異可以引起多種表型的耳聾，而一種耳聾表型也可以由多種基因變異引起。遺傳性耳聾的表型和基因型之間存在一定的因果聯(lián)系，可將表型特征作為定位基因的線索之一。因此，表型特征的分析在耳聾家系的研究中起著至關(guān)重要的作用。本研究對一個以低頻下降起病的耳聾家系進行了臨床資料總結(jié)、聽力學(xué)及遺傳學(xué)特征的分析，為下一步基因鑒定、遺傳咨詢、婚育指導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 家系資料的采集

本研究通過了解放軍總醫(yī)院倫理委員會的倫理論證。本研究中耳聾家系位于福建省某縣，為一個4代相傳的耳聾家系（1507327家系）。先證者為1名52歲的女性因雙耳漸進性聽力下降，于2015年3月就診于中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，在門診進行詳細的病史采集、聽力學(xué)及影像學(xué)檢查，檢查包括：純音測聽、聲導(dǎo)抗、言語識別率、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）、聽性腦干反應(yīng)（ABR）、頸部血管超聲、顳骨CT、內(nèi)聽道水成像等，2017年8月于門診行聽力復(fù)查。家系采集小組赴當(dāng)?shù)貞?yīng)用問卷調(diào)查表對簽署知情同意書的51名家系成員進行了一般情況、現(xiàn)病史、既往史及家族史等信息的采集；應(yīng)用電耳鏡檢查耳道及鼓膜情況；并進行了純音測聽、聲導(dǎo)抗等聽力學(xué)檢查。抽取50名家系成員外周靜脈血樣本10~20ml用于基因組DNA的提取和保存。

1.2 臨床聽力學(xué)檢測

先證者聽力學(xué)檢測在標(biāo)準(zhǔn)隔聲室進行：應(yīng)用Madsen Conera診斷型聽力計（丹麥），TDH-39頭戴式氣導(dǎo)耳機（丹麥），B-71骨導(dǎo)式耳機（丹麥）對先證者進行純音測聽檢查；應(yīng)用上海瑞金醫(yī)院編制的音素平衡50單音節(jié)詞表，由解放軍總醫(yī)院自行錄制合成的詞表CD，對先證者進行言語識別率測試；應(yīng)用Madsen Capella全功能耳聲發(fā)射儀（丹麥），10DPOAE Probe插入式耳機對先證者進行DPOAE檢查；應(yīng)用HIS 4368 Smart EP（美國）測試儀對先證者進行ABR測試。家系其他成員聽力學(xué)檢查由家系采集小組赴當(dāng)?shù)夭杉簯?yīng)用Madsen 502便攜式聽力計（丹麥），TDH-39頭戴式氣導(dǎo)耳機（丹麥），B-71骨導(dǎo)式耳機（丹麥）對家系成員進行純音測聽檢查；應(yīng)用Madsen OTO flex100聲導(dǎo)抗檢測儀（丹麥）檢測鼓室圖及鐙骨肌反射。以上儀器均定時按國際標(biāo)準(zhǔn)進行校準(zhǔn)。

1.3 耳聾表型的分類及判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)是否有全身其他系統(tǒng)器官的受累，將遺傳性耳聾分為綜合征型耳聾與非綜合征型耳聾；（2）根據(jù)語言發(fā)育階段分為語前聾與語后聾；（3）根據(jù)聽力損失性質(zhì)分為傳導(dǎo)性耳聾、感音神經(jīng)性耳聾、混合性耳聾；（4）根據(jù)NIH&WHO 2000年標(biāo)準(zhǔn)[2,3]，耳聾表型根據(jù)聽力損失的頻率分為:：高頻聽力損失型；低頻聽力損失型；覆盆(中間)聽力損失型；全頻聽力損失型；（5）根據(jù)美國言語語言聽力協(xié)會（ASHA）1981年的聽力損失分級方法[4]，將聽力較好耳的語言頻率平均閾值分為6個聽力損失等級：正?！?5dB；輕度：26～40dB；中度：41～55dB；中重度：56～70dB；重度：71～90dB；極重度≥91dB。

1.4 遺傳性耳聾遺傳方式分析

目前國際上公認(rèn)的非綜合征型耳聾遺傳方式有以下幾種：常染色體顯性遺傳方式占15~20%，常染色體隱性遺傳占80%，性染色體-連鎖遺傳方式約占1%[5]。每一種遺傳方式的非綜合征型耳聾均具有獨特的遺傳學(xué)特征。本研究對家系的遺傳特征按照上述不同遺傳方式的特點進行了遺傳學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。年齡與較好耳平均聽閾的關(guān)系采用直線回歸分析。設(shè)年齡為自變量X，較好耳平均聽閾值為因變量Y，采用t檢驗，P<0.05有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 11507327家系資料

該家系位于福建省，共4代，現(xiàn)存家系成員99人，最年長者74歲（Ⅱ:12），最年幼者6歲（Ⅳ:45）。共調(diào)查51名家系成員（含先證者），有聽力損失者共20人（見圖1）。其中15名家系直系親屬為感音神經(jīng)性耳聾，2人為傳導(dǎo)性耳聾（Ⅲ:6，Ⅲ:40），1人為混合性耳聾（Ⅲ:24），另有2名家系配偶為感音神經(jīng)性耳聾（Ⅲ:10、Ⅲ:25）。15名感音神經(jīng)性耳聾患者無噪聲及耳毒性藥物接觸史，12名患者伴有耳鳴，無患者伴發(fā)眩暈，家系聽力損失患者體檢未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)異常。傳導(dǎo)性耳聾及混合性耳聾患者（Ⅲ:6，Ⅲ:40，Ⅲ:24）均有慢性化膿性中耳炎病史。

2.2 1507327家系耳聾表型特征

2.2.1 臨床聽力學(xué)特征

該家系15名感音神經(jīng)性耳聾患者年齡最大者74歲，年齡最小者23歲。自訴發(fā)病年齡從8歲到49歲不等，平均發(fā)病年齡31.7歲，為遲發(fā)型語后聾。聽力圖曲線呈低頻聽力損失型4例，全頻聽力損失型11例。聽力損失程度從輕度到極重度不等，輕度2例，中度4例，中重度3例，重度5例，極重度1例（見表1）。

表1 1507327家系患者聽力表型總結(jié)Table 1 Summary of clinical data for affected members in family 1507327

先證者（Ⅲ:44）2015年2月檢查：平均聽閾左耳75dB HL，右耳55dB HL；言語識別率左耳28%，右耳32%；ABR測試100dB nHL刺激聲下雙耳僅見Ⅴ波，波形嚴(yán)重異常；DPOAE左耳未引出，右耳4kHz引出，其余頻率未引出；頸部血管超聲雙側(cè)均未見異常；顳骨CT及內(nèi)聽道水成像未發(fā)現(xiàn)中耳及內(nèi)耳畸形，未見占位性病變，但提示左側(cè)乳突炎。2017年8月復(fù)查：平均聽閾耳70 dB HL，右耳71.25dB HL。

2.2.2 聽閾與年齡關(guān)系

分析15例感音神經(jīng)性耳聾患者的聽力損失程度，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，各代患者平均聽力損失程度逐漸加重，由輕度發(fā)展至極重度，低頻（125～500Hz）聽力損失也逐漸加重至重度。將年齡作為自變量X，將較好耳平均聽閾作為因變量Y，做線性回歸分析可見，患者的平均聽閾與年齡呈正相關(guān)，有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.001），可用線性回歸方程y=1.180x+4.886（R2=0.618）預(yù)測聽力損失程度與年齡的變化關(guān)系（見圖2、表2）。先證者時隔2年聽力復(fù)查結(jié)果顯示左耳平均聽閾無明顯變化，右耳平均聽閾有16.25dB HL的下降。

2.2.3 1507327家系遺傳學(xué)特征分析

應(yīng)用Cyrillic 2.1軟件根據(jù)家系調(diào)查和聽力檢查結(jié)果繪制系譜圖（見圖1）。通過對1507327家系的系譜圖分析可知：1507327家系共4代，各代連續(xù)發(fā)病，每一代男女均可患病，在進行過聽力測試的家系成員中，Ⅱ代患病率100%（1/1），Ⅲ代患病率61.11%（11/18），Ⅳ代患病率13.04%（3/23）（見表3）。該家系每一代的耳聾平均發(fā)病年齡在27～35歲之間（見表1），Ⅱ代平均發(fā)病年齡35歲，Ⅲ代32.45歲，Ⅳ代27.67歲。由此可見，1507327家系符合典型常染色體顯性遺傳特點：（1）連續(xù)三代以上發(fā)??；（2）男女發(fā)病機會均等；（3）患者的雙親中必有一方為患者，患者的同胞中近半數(shù)患?。唬?）雙親都正常時，子女聽力均正常；（5）男女患者均可將耳聾表型傳遞給后代。

圖1 1507327家系-常染色體顯性遺傳性耳聾系譜圖Fig.1 Pedigree of the family 1507327

圖2 1507327（A）家系患者-典型聽力曲線；（B）家系內(nèi)不同患者聽力較好耳平均聽閾和年齡的趨勢散點圖，n=15，P=0.001，有統(tǒng)計學(xué)意義。（C）先證者2015年與2017年的氣導(dǎo)聽力變化Fig.2 (A)Typical hearing curve of affected family members,(B)Scatterplot of the average threshold in different patients’better ears along with the age,n=15，P=0.001，Statistically significant.(C)Comparison of air conduction hearing of proband in 2015 and 2017.

表2 1507327家系每一代患者聽閾與年齡關(guān)系Table 2 The relationship between auditory threshold and age of patients in each generation in family 1507327

3 討論

遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，而耳聾基因與耳聾表型之間又存在一定的因果聯(lián)系?；蛐褪潜硇偷倪z傳學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，而表型又因為環(huán)境等因素的影響具有多樣性。本研究中的耳聾家系圖譜分析表現(xiàn)為常染色體顯性的遺傳模式，具有遲發(fā)型、語后聾、漸進性等常見的非綜合征常染色體顯性耳聾（autosomal dominant non-syndromic sensorineural hearing loss,ADNSHL）家系特征，也表現(xiàn)出一些獨有的表型特點。首先，發(fā)病年齡從8歲到49歲，除一名患者（Ⅲ:11）8歲發(fā)病，均為20歲以上發(fā)病，平均發(fā)病年齡31.7歲，發(fā)病年齡有逐代提前的趨勢，同時外顯率逐代降低。其次，以輕度低頻聽力損失起病，逐漸累及中高頻；對家系內(nèi)不同患者年齡及聽力損失程度進行線性回歸分析提示：較好耳聽力損失每年增加約1.1801dB HL，并在60歲以上的家系成員中出現(xiàn)極重度和全聾。先證者2年內(nèi)右耳平均聽閾降低幅度超過回歸方程的預(yù)測，可能與個體差異、環(huán)境、測試狀態(tài)、測量誤差等因素有關(guān)。

已知的ADNSHL相關(guān)基因大多導(dǎo)致高頻性聽力損失[6]，只有少數(shù)基因變異引起低頻感音神經(jīng)性聽力損失（low frequency sensorineural hearing loss，LFSNHL），這些基因包括：DIAPH1（DFNA1）、WFS1（DFNA6/14/38）、CCDC5D（DFNA44）、TNC（DF?NA56）[7-12]。其中，WFS1基因突變引起LFNSHL的報道較多[13-18]，在人群中較為常見，在日本一項研究中有2.5%（15/602）的ADNSHL家庭檢出了該基因的變異[19]。WFS1導(dǎo)致的耳聾聽力損失較輕，局限于低頻，較為穩(wěn)定[8,20]，這與本研究家系表型特征有較大的差別。另外三種基因所致的耳聾都表現(xiàn)為低頻蔓延至全頻，聽力損失程度逐漸發(fā)展的漸進性語后聾[7,11,12]，在發(fā)病年齡，聽力損失程度，伴發(fā)癥狀上各自存在一些差別：如DIAPH1發(fā)病年齡在10歲左右[7]；CCDC5D為6-10歲[11]；TNC發(fā)病年齡為8-30歲[12]；CCDC5D以中度聽力損失起病[11]；DIAPH1可伴有血液學(xué)的異常，表現(xiàn)為巨血小板減少癥（mac?rothrombocytopenia，MTP）[21-23]。本研究家系可以完善血液學(xué)檢查以幫助致病基因的鑒定。其他一些低頻相關(guān)性的ADNSHL，如DFNA31、DFNA 49、DF?NA 54、DFNA 57仍未找到相應(yīng)的致病基因[24-27]。

另外，聽神經(jīng)病作為一種特殊的感音神經(jīng)性耳聾也可表現(xiàn)為低頻聽力損失，但需要滿足[28]：（1）毛細胞的功能正常，即耳聲發(fā)射（OAE）和/或耳蝸微音器電位（CM）可引出；（2）聽神經(jīng)功能異常，即聽性腦干反應(yīng)（ABR）異?；蛉肯В唬?）同時多可伴有中樞或周圍神經(jīng)病變。該家系先證者（Ⅲ:44）ABR嚴(yán)重異常，DPOAE右側(cè)4kHz可引出，言語識別率差，影像學(xué)檢查顯示左側(cè)中耳炎癥，不排除由于左側(cè)中耳炎癥干擾導(dǎo)致左側(cè)DPOAE幅值降低或引不出，因此尚不能排除聽神經(jīng)病的可能性?？蓪ο茸C者完善耳蝸微音器電位檢查以檢測外毛細胞功能。其他家系患者也可增加ABR潛伏期、ABR閾值、DPOAE、耳蝸電圖、言語識別率、顳骨CT等檢查，以排除或確定聽神經(jīng)病。目前至少發(fā)現(xiàn)17個聽神經(jīng)病相關(guān)基因，包括OTOF、PJVK、DIAPH3、AIFM1、PMP22、MPZ、NF-L、NDRG1、GJB1、GJB3、OPA1、TMEM126A、TIMM8A、WFS1、FXN及線粒體基因突變12S rRNA（T1095C）、MTND4（11778mtD?NA）[29]，其中只有DIAPH3[30]引起的聽神經(jīng)病呈現(xiàn)常染色體顯性遺傳模式。

綜上所述DIAPH1、CCDC5D、TNC、DIAPH3等耳聾基因可作為候選基因進行Sanger驗證。經(jīng)典的耳聾基因研究常采用候選基因或連鎖分析位置候選基因法，但它們耗時、費用高、有時難以發(fā)現(xiàn)致病基因。耳聾基因Panel測序或全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）等新一代測序技術(shù)（next-generation sequencing technology,NGS），其具有經(jīng)濟、精確、可行、周轉(zhuǎn)時間短等優(yōu)勢[31]。對于非編碼區(qū)特殊位點的突變和基因組大片段的缺失或插入（insertion and deletion，InDel），以及拷貝數(shù)的變化（copy number variation，CNV）等涉及到基因組結(jié)構(gòu)的變異（SV）則可應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array based comparative genomic hybridization，aCGH)及全基因組重測序（whole genome sequenc?ing）來擴大搜索范圍。

總之，在耳聾家系研究中，我們應(yīng)該珍惜我國豐富的耳聾家系資源，綜合運用多種基因分析策略，力求科學(xué)、高效、經(jīng)濟地得到耳聾基因信息。本研究也將為今后遺傳性耳聾家系候選基因的篩選思路提供參考，也有助于低頻相關(guān)性耳聾的遺傳咨詢和診斷分析。

表3 1507327家系患者每代患病率Table 3 Prevalence per generation in family 1507327