梁鵬飛 王錦玲 王劍 王淑娟 邱建華 查定軍

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

聽神經(jīng)病(auditory neuropathy，AN)是一種有特 殊臨床表現(xiàn)的聽力障礙性疾病。最早由Starr等[1]提出，認(rèn)為自耳蝸至進(jìn)入腦干之前的第VIII腦神經(jīng)聽支（耳蝸神經(jīng)）受損。主要的臨床表現(xiàn)包括：反應(yīng)內(nèi)毛細(xì)胞及聽覺傳導(dǎo)通路功能的聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)缺失或嚴(yán)重異常，而主要反應(yīng)外毛細(xì)胞功能的誘發(fā)性耳聲發(fā)射(evoked otoacoustic emission，EOAE)正?；蚧菊＃哉Z(yǔ)識(shí)別率顯著差于純音聽閾水平等。王錦玲等[2]對(duì)286例聽神經(jīng)病患者進(jìn)行臨床流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示聽神經(jīng)病患者約占同期聽力減退患者的1.37%，而在各種原因所致的ABR異常的聾病患兒中發(fā)病率高達(dá)11%[3]。

目前聽神經(jīng)病的發(fā)病機(jī)理不明，隨著相關(guān)基因的不斷發(fā)現(xiàn)，開始從分子水平上揭示聽神經(jīng)病譜系障礙的病理機(jī)制。OTOF基因是非綜合征型隱性遺傳性感音神經(jīng)性耳聾（DFNB9）的致病基因，也是最早確定的與非綜合征型隱性遺傳性聽神經(jīng)病相關(guān)的基因[4]。近年來(lái)，研究學(xué)者們?cè)诼犐窠?jīng)病家系及散發(fā)患者中，廣泛開展了OTOF基因的篩查研究，報(bào)道了多個(gè)可引起聽神經(jīng)病表型的病理性突變位點(diǎn)，但國(guó)內(nèi)尚缺乏散發(fā)聽神經(jīng)病患者的大樣本OTOF基因突變檢測(cè)的臨床研究。本課題收集248例聽神經(jīng)患者進(jìn)行OTOF基因全部編碼區(qū)序列檢測(cè)，以期明確與我國(guó)聽神經(jīng)病相關(guān)OTOF基因的高發(fā)突變位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究中的聽神經(jīng)病患者的臨床資料和外周血樣本均來(lái)自于空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科聾病基因診斷中心。所收集到到的病例主要來(lái)自中國(guó)西部及中部地區(qū)。本研究中的受檢者包括2009至2018年收集的聽神經(jīng)病患者248例，其中男性126例，女性122例，年齡1歲至44歲，平均年齡22.51±9.94歲。全部患者進(jìn)行純音聽閾測(cè)試、聲導(dǎo)抗、耳聲發(fā)射（DPOAE）、聽性腦干反應(yīng)（ABR）、言語(yǔ)識(shí)別率、眼震電圖（ENG）、前庭誘發(fā)肌源電位（VEMP）以及顳骨CT掃描，嬰幼兒行聽性穩(wěn)態(tài)反應(yīng)檢查。每位患者均進(jìn)行詳細(xì)的病史采集，包括基本信息、耳聾病史、個(gè)人史、母親孕期身體狀況、用藥史、外傷史、家族史等。排除與國(guó)外種族聯(lián)姻家族或近親聯(lián)姻家族，以及有外耳、中耳畸形患者。有家族史者只計(jì)入先證者。前期工作篩查常見耳聾基因（GJB2基因、SLC26A4基因、線粒體12SrRNA1555以及1494位點(diǎn)）均為陰性。同時(shí)選取100名地域相當(dāng)?shù)穆犃φＨ俗鳛閷?duì)照組。

1.2 聽神經(jīng)病患者臨床癥狀診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]

1、純音聽閾以低頻減退為主；2、言語(yǔ)識(shí)別率不成比例地差于純音聽閾；3、鐙骨肌聲反射同側(cè)及交叉聲反射不能引出或閾值升高；4、ABR波形缺失或嚴(yán)重異常；5、DPAOE和（或）微音電位（CM）正常；6、影像學(xué)檢查（顳骨CT和/或內(nèi)聽道MRI）正常。

1.3 血液DNA提取

患者或其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書后，抽取被檢測(cè)者外周靜脈血3-5ml，EDTA抗凝，采用康為世紀(jì)中量全血基因組提取試劑盒提取基因組DNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)純度，滿足OD260/280=1.7-2.0，取適量樣本稀釋至濃度100-200ng/μl，剩余置-80℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)

參照美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因數(shù)據(jù)庫(kù)中人類OTOF基因標(biāo)準(zhǔn)序列（基因ID：9381）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增全部編碼區(qū)及剪切位置，見表1。

所有引物均使用Primer3在線軟件設(shè)計(jì)，由西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)采用50μl體系，包括2Pfu PCR Mas?terMix 25μl，上下游引物各 1μl，DNA 模板 2μl，ddH2O 21μl，PCR擴(kuò)增條件采用Touchdown方法，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，62℃起始退火30s，72℃延伸30s，12個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃；隨后95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min后，4℃保存。如圖1所示。

圖1 PCR反應(yīng)條件Fig.1 PCR condition

1.6 基因序列比對(duì)及相關(guān)生物學(xué)分析

248例被檢測(cè)對(duì)象的基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI 3700 DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同。結(jié)果使用Chromos軟件讀取并利用Seqman軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

本研究中共設(shè)計(jì)35對(duì)引物，涵蓋了OTOF基因的所有48個(gè)外顯子及其側(cè)翼區(qū)域，擴(kuò)增片段與預(yù)期一致。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)序列（NM_194248.2）進(jìn)行比對(duì)，共在20例聽神經(jīng)病患者中發(fā)現(xiàn)9種可能致病的突變方式，包括7種錯(cuò)義突變和2種剪切方式的改變（表2），OTOF基因突變檢出率為8.06%（20/248）。同時(shí)還檢出4種已有文獻(xiàn)報(bào)道的多態(tài)性改變（表3）。9種可能的致病突變方式中，位于40號(hào)外顯子的c.5026C>T檢出率最高（6/248），共有7人存在Exon40的突變。結(jié)果顯示，248名聽神經(jīng)病患者OTOF突變集中在Exon40、In?tron32、Exon12、Exon18、Exon24、Intron28和 Exon7中（依檢出數(shù)目由高至低）。

表1 OTOF基因擴(kuò)增引物Table 1 Sequence of primers used for OTOF amplification

本研究在1例兒童聽神經(jīng)病患者的基因組中，檢測(cè)到OTOF基因發(fā)生c.2977-2978delAG/c.3570+2T>C復(fù)合雜合突變。該名患者首次就診年齡7歲，男童，聽力測(cè)試結(jié)果（圖2）顯示：雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聽力損失；聲導(dǎo)抗檢測(cè)雙耳均為As型曲線，雙耳聲反射閾均未引出；右耳2-8kHz可引出DPOAE，左耳0.75-8kHz可引出DPOAE；ABR閾值雙耳＞100dBnHL；雙側(cè)顳骨CT及內(nèi)聽道MRI均未見異常。

圖2 攜帶OTOF c.2977-2978delAG/c.3570+2T>C突變患者聽力學(xué)表現(xiàn)Fig.2 Audiological performances of the patient with OTOF c.2977-2978delAG/c.3570+2T>C mutation

表2 248名患者OTOF基因可能致病突變統(tǒng)計(jì)Table 2 Probable-pathogenic variants of OTOF identified in 248AN patients

表3 OTOF基因多態(tài)性改變Table 3 polymorphic changes of OTOF

3 討論

人類OTOF基因位于2p23.3，基因DNA序列全長(zhǎng)101496bp，共有4種長(zhǎng)短不同的轉(zhuǎn)錄變異體，其中最長(zhǎng)的亞型包含48個(gè)外顯子，其中外顯子1未被編碼，編碼長(zhǎng)度為1997個(gè)氨基酸的OTOFER?LIN蛋白。

OTOF基因是1999年由Yasunage等[12]定位并命名，并被認(rèn)為是常染色體隱性遺傳性非綜合征型耳聾(DFNB9)的致病基因。2003年Varga R等[4]通過連鎖分析及突變檢測(cè)的方法，證明OTOF基因突變是導(dǎo)致非綜合征型隱性聽神經(jīng)病家系的致病原因。免疫熒光染色結(jié)果顯示，胚胎期小鼠的耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞以及螺旋神經(jīng)節(jié)部位均可檢測(cè)到OTOFERLIN蛋白的表達(dá)，而在成熟小鼠的耳蝸，OTOFERLIN蛋白集中于內(nèi)毛細(xì)胞基底外側(cè)部以及帶狀突觸小泡和突觸前膜上。OTOF基因敲除小鼠呈現(xiàn)出功能性外毛細(xì)胞以及聽神經(jīng)，推測(cè)重度聽力障礙是由于內(nèi)毛細(xì)胞的功能缺陷所致[13]。

近年來(lái)，在非綜合征型聽神經(jīng)病患者中開展OTOF基因篩查已成為疾病分子病因?qū)W研究的熱點(diǎn)課題，至今在不同地區(qū)和人群中報(bào)道了多個(gè)可引起聽神經(jīng)病表型的病理性突變位點(diǎn)[6-11]。本課題在248例的聽神經(jīng)病患者中，篩查OTOF全部編碼區(qū)序列，共檢出9種OTOF可能致病方式。這些突變集中在Exon40、Intron32、Exon12、Exon18、Exon24、In?tron28和Exon7中。在門診耳聾患者或者聽力正常人群中，開展相關(guān)外顯子的篩查，將對(duì)攜帶者的婚育具有指導(dǎo)意義。我們的研究發(fā)現(xiàn)攜帶這些突變的患者多為單雜合形式存在，僅有1例患者為OTOF基因復(fù)合雜合突變攜帶者。既往的文獻(xiàn)表明，OTOF基因是一種隱性致病基因，單等位基因突變尚無(wú)法確定其致病性，只有發(fā)生雙等位基因突變才會(huì)出現(xiàn)聽神經(jīng)病癥狀，說明OTOF基因并不是大多數(shù)受檢患者的唯一患病原因。隨著對(duì)聽神經(jīng)病的深入研究和臨床聽力學(xué)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，目前聽神經(jīng)病的發(fā)病率高于以往的報(bào)道。而基因檢測(cè)手段的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的基因被認(rèn)為與聽神經(jīng)病相關(guān)。迄今為止，發(fā)現(xiàn)的非綜合征型聽神經(jīng)病相關(guān)的基因除了OTOF基因以外，還包括PJVK、DIAPH3、SLC17A8、DIAPH3等[14]，王秋菊教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上首次報(bào)道了一個(gè)X-連鎖隱性遺傳性聽神經(jīng)病基因作為（AUNX1）基因座[15]，并發(fā)現(xiàn)AIFM1基因具有高度相關(guān)性[16]。在接下來(lái)的工作中，我們將繼續(xù)進(jìn)行上述基因的檢測(cè)研究，以期豐富聽神經(jīng)病相關(guān)基因的突變篩查譜。