張圣新 朱磊 鮑恩東 王冉 魏瑞成

評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（南京）/江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，江蘇南京 210014; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095] 摘要：為了監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)排污水中獸藥抗生素污染狀況，擬建立1種固相萃取-高效液相色譜方法測(cè)定養(yǎng)殖場(chǎng)污水中強(qiáng)力霉素殘留。養(yǎng)殖場(chǎng)排污水離心后取上清液過(guò)濾膜并調(diào)整溶液pH值，分別采用固相萃取柱進(jìn)行富集和洗脫，氮吹濃縮處理，C18色譜柱分離，0.01 mol/L乙二酸溶液+甲醇-乙腈溶液洗脫。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線在1～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999 8;在10～50 μg/L添加濃度范圍內(nèi)，強(qiáng)力霉素平均回收率為91.55%～9514%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.66%～6.45%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～0.75%，該方法的檢測(cè)限為 0.1 μg/mL。該方法操作簡(jiǎn)便、高效，適用于養(yǎng)殖場(chǎng)排污水中強(qiáng)力霉素殘留的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞：強(qiáng)力霉素;固相萃取;高效液相色譜;抗生素殘留;檢測(cè)方法

中圖分類(lèi)號(hào)：X839.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0249-03

獸藥抗生素在現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展和動(dòng)物性產(chǎn)品的豐富供給方面發(fā)揮了重要作用。據(jù)報(bào)道，2013年我國(guó)用在養(yǎng)殖業(yè)中的抗生素量約為8.4萬(wàn)t，約占其生產(chǎn)總量的52%，相當(dāng)于美國(guó)養(yǎng)殖業(yè)使用量的6倍[1]。然而藥物在動(dòng)物體內(nèi)的利用效率不高，高達(dá)90%的飼用抗生素將以母體或代謝產(chǎn)物的形式隨畜禽糞尿排出體外，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染[2-3]。目前，在動(dòng)物糞便、土壤、水體等樣品中檢出多種抗生素殘留[2，4-6]，其中四環(huán)素類(lèi)藥物作為養(yǎng)殖場(chǎng)常用獸藥，在環(huán)境中的檢出率相對(duì)較高[7-8]。強(qiáng)力霉素（doxycycline，簡(jiǎn)稱DOX）為四環(huán)素類(lèi)抗生素的一種，于1967年獲得食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，簡(jiǎn)稱FDA）批準(zhǔn)，因其具有良好的組織穿透性、分布廣和抑菌作用強(qiáng)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[9]，是目前養(yǎng)殖業(yè)使用的主要四環(huán)素類(lèi)藥物之一。飼喂動(dòng)物后，約有85%的強(qiáng)力霉素以原形或代謝物形式隨糞尿排出[10]。養(yǎng)殖場(chǎng)水沖糞、水泡糞清糞工藝產(chǎn)生的污水較多，殘留的抗生素隨同污水排放進(jìn)入環(huán)境，使得環(huán)境中微生物處于長(zhǎng)期選擇壓下，將誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗性[11]，破壞環(huán)境生態(tài)平衡，并發(fā)生縱向傳遞和橫向傳播，對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品安全造成威脅[12-13]。

目前，已報(bào)道的強(qiáng)力霉素檢測(cè)方法主要用于動(dòng)物產(chǎn)品和飼料等養(yǎng)殖投入品[14-15]，養(yǎng)殖污水等環(huán)境基質(zhì)中強(qiáng)力霉素殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)缺失，色譜檢測(cè)方法也鮮有報(bào)道。因此，建立方法簡(jiǎn)便、快速、高效和靈敏的養(yǎng)殖糞污水中強(qiáng)力霉素殘留的測(cè)定方法，可為研究強(qiáng)力霉素在環(huán)境中的行為、評(píng)估其對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)以及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支撐，也為糞污中其他類(lèi)抗生素測(cè)定方法的建立提供參考和借鑒，對(duì)抗生素的科學(xué)監(jiān)管、合理使用以及制定養(yǎng)殖場(chǎng)抗生素排放標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。強(qiáng)力霉素的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97.0%），購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer公司;甲醇和乙腈（色譜純），購(gòu)自美國(guó)天地（TEDIA）公司;鹽酸和氫氧化鈉（分析純），購(gòu)自南京化學(xué)試劑一廠;乙二胺四乙酸二鈉和乙二酸（分析純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸和磷酸氫二鈉（分析純），購(gòu)自西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent 1100S，配二極管陣列檢測(cè)器DAD），購(gòu)自Agilent公司;分析天平（AL204）、pH計(jì)（320），購(gòu)自梅特勒-托利多儀器有限公司;漩渦混合器（XW-80A），購(gòu)自上海琪特分析儀器有限公司;調(diào)速多用振蕩器（HY-4），購(gòu)自常州國(guó)華電器有限公司;高速離心機(jī)（Eppendorf），購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;超純水儀（Milli-Q），購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;氮吹儀（N-EVAPTM112），購(gòu)自美國(guó)Organomation公司;固相萃取裝置，購(gòu)自美國(guó)Supelco公司;HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL），購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，吸取一定量的儲(chǔ)備液，用甲醇配成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20 ℃避光存放。用流動(dòng)相稀釋中間液配制濃度為1、5、7、10、20 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光存放，1周更換。

1.4 提取和凈化方法

污水取自養(yǎng)殖場(chǎng)凈化池后流出液，將采集的樣品低溫運(yùn)送回試驗(yàn)室，4 ℃、8 000 r/min離心后取上清液過(guò)0.8 μm濾膜，加入20 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-檸檬酸緩沖溶液到1 L過(guò)濾樣液中，調(diào)節(jié)pH值至6后過(guò)HLB（親脂-親水平衡）柱凈化。固相萃取HLB柱依次用甲醇和0.1 mol/L Na2EDTA-檸檬酸緩沖溶液（pH值為4）各6 mL進(jìn)行活化，然后取 100 mL 調(diào)節(jié)pH值后的樣液過(guò)柱凈化，樣液裝載流速為 3 mL/min，用10 mL水淋洗并真空抽干，然后用8 mL甲醇洗脫，洗脫速度為1 mL/min，在10 mL離心管中收集洗脫液，在40 ℃水浴中用氮?dú)鉂饪s至近干，加入1 mL流動(dòng)相溶解殘余物，過(guò)0.22 μm孔徑有機(jī)濾膜后用于高效液相色譜儀測(cè)定。

1.5 高效液相色譜（HPLC）測(cè)定

色譜柱為Agilent C18 250 mm×4.6 mm，5 μm;流動(dòng)相001 mol/L乙二酸溶液 ∶ 甲醇-乙腈溶液（甲醇和乙腈體積比為1 ∶ 1）比例為65 ∶ 35;柱溫為30 ℃;流速設(shè)定為1.0 mL/min;檢測(cè)器波長(zhǎng)為350 nm;進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

為了減少樣品中雜質(zhì)峰的干擾，試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的配比進(jìn)行了優(yōu)化，選擇0.01 mol/L乙二酸溶液+甲醇-乙腈為流動(dòng)相，比較流動(dòng)相組成比例分別為60 ∶ 40、65 ∶ 35和70 ∶ 30時(shí)對(duì)色譜峰的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相中的甲醇-乙腈增加時(shí)，即有機(jī)相的比例增加時(shí)，強(qiáng)力霉素出峰時(shí)間前移，目標(biāo)物的色譜峰與樣品中的雜質(zhì)峰分離度降低;當(dāng)有機(jī)相組成減少時(shí)，強(qiáng)力霉素出峰時(shí)間延后，將增加樣品分析的時(shí)間與試驗(yàn)成本，尤其是在對(duì)批量樣品分析的情況下。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，流動(dòng)相配比為65 ∶ 35時(shí)可以較好地滿足分析需要。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

養(yǎng)殖場(chǎng)凈化池為糞水混合物，在好氧與厭氧發(fā)酵等條件下，依靠物理化學(xué)和微生物的作用促進(jìn)殘留抗生素的降解。由于產(chǎn)生的污水多為懸濁液，易堵塞固相萃取柱，影響過(guò)柱效率及降低吸收富集的效果。試驗(yàn)中通過(guò)高速離心去除大顆粒懸浮物的干擾，然后利用0.8 μm水相濾膜過(guò)濾掉溶液中的小粒徑顆粒，強(qiáng)力霉素屬于小分子化合物，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)離心和過(guò)濾基本不影響其在污水中的殘留。

2.3 固相萃取-高效液相色譜法的建立

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 對(duì)1～20 μg/mL強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定4次取平均值，根據(jù)色譜峰面積（y）與強(qiáng)力霉素濃度（x）作線性回歸分析，強(qiáng)力霉素在濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=10.456 0x-2.277 8，相關(guān)系數(shù)大于0.99。強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和添加樣品在試驗(yàn)優(yōu)化的色譜條件下的譜圖見(jiàn)圖2，目標(biāo)藥物色譜保留時(shí)間為 9.706 min，由于室溫的影響，色譜保留時(shí)間在很小范圍內(nèi)波動(dòng)，控制柱溫可以消除影響，在分析過(guò)程中目標(biāo)物色譜峰與雜質(zhì)峰具有很好的分離度，保證了目標(biāo)化合物分析的準(zhǔn)確性。

2.3.2 回收率、精密度與檢出限 用空白污水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液到空白污水中，配成強(qiáng)力霉素濃度分別為10、20、50 μg/L的待測(cè)樣品，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。分別取100 mL待測(cè)樣液按照上述處理方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行制備處理，進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算強(qiáng)力霉素在養(yǎng)殖污水中批內(nèi)和批間的回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。強(qiáng)力霉素平均回收率為91.55%～95.14%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 1.66%～6.45%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～0.75%，說(shuō)明該方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性。以能夠產(chǎn)生3倍信噪比（S/N=3）所對(duì)應(yīng)的藥物濃度計(jì)算方法檢測(cè)限（MDL），目標(biāo)藥物的MDL為0.1 μg/mL[16]。

2.4 方法應(yīng)用

利用建立的分析方法測(cè)定了6個(gè)豬場(chǎng)凈化池流出的污水樣品，分析結(jié)果顯示，豬場(chǎng)污水樣品中強(qiáng)力霉素濃度為0～1508 μg/L。對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收，評(píng)價(jià)本方法分析實(shí)際樣品的能力，結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為88.5%～90.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9%，評(píng)價(jià)結(jié)果滿足方法準(zhǔn)確度和精密度的要求。

3 討論

在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，由于色譜柱C18反向鍵合相表面分布有硅醇基，四環(huán)素類(lèi)藥物分子基團(tuán)與其發(fā)生締合，將造成強(qiáng)力霉素色譜峰在分析柱上的拖尾，影響色譜峰寬及目標(biāo)化合物定量分析的準(zhǔn)確性。因此，為了減少?gòu)?qiáng)力霉素色譜峰拖尾情況的發(fā)生，本研究通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相的組成，在流動(dòng)相中加入一定濃度的乙二酸溶液，以減少目標(biāo)分析物與分析柱之間的鍵合作用力，從而有效減少色譜峰拖尾現(xiàn)象的產(chǎn)生[17]。此外，在試驗(yàn)過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場(chǎng)污水的pH值會(huì)對(duì)目標(biāo)物的回收率產(chǎn)生一定影響。所以本研究通過(guò)添加回收試驗(yàn)，比較了將基質(zhì)pH值分別調(diào)整為3和6時(shí)對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，獲得最適樣品酸堿度。當(dāng)pH值為3時(shí)，強(qiáng)力霉素回收率偏低，研究發(fā)現(xiàn)在加樣后的固相萃取柱流出液、淋洗液及隨后的洗脫液中，檢出了強(qiáng)力霉素特征峰，提取液的強(qiáng)酸性改變了固相萃取柱的吸附作用，導(dǎo)致目標(biāo)藥物在柱上保留不充分;將提取液pH值調(diào)整為6時(shí)，回收效果滿足試驗(yàn)要求，表明弱酸性溶劑有利于四環(huán)素類(lèi)藥物在固相萃取柱中富集。同時(shí)在樣品處理過(guò)程和固相萃取柱的預(yù)處理液中加入一定濃度的Na2EDTA溶液，可以有效降低樣品中強(qiáng)力霉素與二價(jià)離子螯合程度[18]，提高目標(biāo)物的回收率。

4 結(jié)論

通過(guò)高速離心去除糞污中懸浮固體物質(zhì)、固相萃取柱去除雜質(zhì)和富集凈化、優(yōu)化溶液pH值及流動(dòng)相的組成和配比，使得強(qiáng)力霉素的色譜峰與干擾峰分離效果良好。與現(xiàn)有方法比較，高效液相色譜法具有樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)便、試劑消耗低的優(yōu)點(diǎn)，本方法處理簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)靈敏，適用于養(yǎng)殖場(chǎng)污水中強(qiáng)力霉素殘留的快速測(cè)定，為監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖業(yè)抗生素污染和制訂養(yǎng)殖場(chǎng)抗生素排放標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支撐，也為建立糞污中其他類(lèi)抗生素測(cè)定方法提供了參考和借鑒。

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收稿日期：2019-01-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（編號(hào)：GJFP2018012、GJFP2019012）。

作者簡(jiǎn)介：張圣新（1992—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事抗生素安全評(píng)價(jià)研究。E-mail：17351781405@163.com。

通信作者：魏瑞成，博士，副研究員，主要從事抗生素安全評(píng)價(jià)研究。E-mail：rcwei79@jaas.ac.cn。