張丹麗，張苗苗，田菁，李悅銳，張虎芳

(1.太原師范學(xué)院 生物系，山西 晉中 030619；2.忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州 034000)

線粒體是真核細(xì)胞中重要細(xì)胞器之一，存在基因組。線粒體基因組因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、相對(duì)于核基因組較快的進(jìn)化速率，含有大量的直同源基因等特點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)學(xué)及進(jìn)化生物學(xué)的研究。線粒體基因組的核苷酸序列、基因含量、基因排列方式，均可提供系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)。線粒體基因組tRNA (transfer RNA)基因是具有攜帶并轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸功能的一類小分子核糖核酸。線粒體DNA 編碼22個(gè)tRNA，用于轉(zhuǎn)運(yùn)20種氨基酸，可以滿足線粒體蛋白質(zhì)翻譯過程中所有密碼子的需要。tRNA長(zhǎng)度一般在73～93 bp之間，可排布成三葉草型結(jié)構(gòu)。由于tRNA 基因序列較短，所以長(zhǎng)期以來的系統(tǒng)發(fā)育研究中對(duì)其關(guān)注較少，抑或只是關(guān)注其在線粒體基因組中的位置變化。目前，關(guān)于昆蟲線粒體tRNA研究中較多的是其一級(jí)結(jié)構(gòu)核苷酸序列應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究分析中及對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。在已有的研究中，Chiotis[1]對(duì)臭蟻亞科包括外群在內(nèi)的17屬的tRNA-Ile的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，與根據(jù)Cytb、CO1的氨基酸序列得到的系統(tǒng)發(fā)育假設(shè)吻合度很高，所以tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能比序列本身提高了信息的利用率。由于每一種tRNA 都很小，所能提供的信息十分有限，而且目前對(duì)于不同分類階元水平上tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較研究十分欠缺。

蝎蝽次目隸屬于昆蟲綱半翅目異翅亞目，共包括6總科11科，之前基于蝎蝽次目的系統(tǒng)發(fā)育多是以線粒體基因組中13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和核糖體RNA中的12S和16S為主[2～4]，而基于tRNA及其二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究則較少。本研究選取類群全面，覆蓋了蝎蝽次目11科，將蝎蝽次目線粒體基因組中所有的tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)信息綜合在一起，則tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有可能得到更好的應(yīng)用。

本研究以半翅目異翅亞目蝎蝽次目為研究對(duì)象，選取已獲得線粒體基因組序列的蝎蝽次目6總科11科12種，通過MITOS獲取22個(gè)tRNA序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)蝎蝽次目11科tRNA的基因序列特征、遺傳距離、同源基因相同核苷酸百分比和tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較研究，并將結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行校正后的tRNA串聯(lián)序列進(jìn)行建樹，以頭喙亞目1種和黽蝽次目2種為外群，采用最大似然法和貝葉斯法探討蝎蝽次目總科及科間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，補(bǔ)充了tRNA在蝎蝽次目研究中的不足。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以蝎蝽次目6總科12個(gè)種為研究對(duì)象，覆蓋了蝎蝽次目11科，從GenBank下載了12個(gè)種的所有22個(gè)tRNA基因序列(表1)。

表1 本研究所選物種Table 1 List of species used in this study

1.2 分析方法

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索蝎蝽次目11科代表種全線粒體基因組序列，下載12個(gè)代表種所有的22個(gè)tRNA基因序列，并通過RNA structure 5.8[5]推測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。在MEGA 6.0[6]中計(jì)算22個(gè)tRNA基因的堿基長(zhǎng)度、堿基組成、AT含量、AT偏斜和GC偏斜，同時(shí)計(jì)算保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。在BioEdit 7.1[7]中對(duì)每一個(gè)同源tRNA基因用ClustalW進(jìn)行比對(duì)，基于比對(duì)的結(jié)果在tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中標(biāo)注11科代表種的保守位點(diǎn)，并總結(jié)tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中莖環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。在BioEdit 7.1中計(jì)算每組同源基因的相同核苷酸百分比(Percent of identical nucleotides，%INUC)。在MEGA 6.0中基于Kimura-2-Parameter(K-2-P)計(jì)算科間遺傳距離。在RAxML 8.2.8[8]和 Mrbayes 3.2.5[9]中分別基于最大似然法(Maximum Likelihood，ML)和貝葉斯法(Bayesian inference，BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。進(jìn)化模型利用jModelTest 2.1.1[10]測(cè)得為GTR+I+G模型。所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹采用Figtree 1.4.3查看并進(jìn)行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 tRNA基因序列特征及遺傳距離分析

蝎蝽次目11科12個(gè)代表種的22個(gè)線粒體tRNA基因在60～80 bp之間，序列總長(zhǎng)略有差異，每一個(gè)同源tRNA基因比對(duì)后未發(fā)現(xiàn)大段的插入和缺失，將比對(duì)后的22個(gè)同源tRNA基因串聯(lián)起來得到1 525 bp序列，其中含有764個(gè)保守位點(diǎn)，742個(gè)變異位點(diǎn)，443個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。

對(duì)蝎蝽次目12個(gè)代表種核苷酸組成分析如表2所示，蝎蝽次目22個(gè)tRNA基因長(zhǎng)度在1 428～1 481 bp之間，4種堿基(A、T、G、C)的組成比例并不均衡，(A+T)%含量在70%～80%之間，平均含量為76.41%，反映了核苷酸組成的AT偏好性。其中仰泳蝽科(Helotrephessp.)AT含量最高為79.08%，小劃蝽科(Micronectasahlbergii)最低為73.81%。核苷酸組成偏好如圖1所示，12個(gè)代表種堿基A和T的含量均高于G和C，其中除了Helotrephessp. 和DiplonychusrusticusT稍高于A之外，其余種A均高于T，所有種G均高于C。堿基組成的偏向性(Strand-specific bias)或稱為鏈組成的不對(duì)稱性(Strand Asymmetry)由AT偏斜(AT skewed=(A-T)/(A+T))與GC偏斜(GC skewed=(G-C)/(G+C))來表示，其中A、T、G與C分別表示一條鏈上相應(yīng)4種堿基的含量。正值代表A含量高于T，G含量高于C。12個(gè)種tRNA基因均表現(xiàn)為GC偏斜，除了蚤蝽科(Helotrephessp.)和負(fù)子蝽科(Diplonychusrusticus)為TA偏斜外，其余均為AT偏斜(表2；圖1)。

表2 蝎蝽次目核苷酸組成分析Table 2 Nucleotide composition of Nepomorpha mitochondrial genome

通過MEGA 7.0對(duì)蝎蝽次目12個(gè)種11個(gè)科科間的遺傳距離進(jìn)行計(jì)算(表3)。由表3可以看出，蝎蝽次目科間的遺傳距離在0.13～0.26之間。6總科內(nèi)的遺傳距離在0.06～0.23之間，仰泳蝽總科內(nèi)的遺傳距離最小為0.06，小劃蝽總科內(nèi)的遺傳距離最大為0.23。

圖1 核苷酸組成Fig.1 Nucleotide composition

2.2 tRNA同源基因相同核苷酸百分比(%INUC，Percent of identical nucleotides)

在蝎蝽次目12個(gè)種內(nèi)，tRNA同源基因相同核苷酸百分比如圖2所示，核苷酸序列保守性較高的tRNA基因主要是tRNA-L2、tRNA-T和tRNA-M(%INUC>61)，其中tRNA-L2 的保守性最高；上述這些核苷酸保守性較高的tRNA基因均位于線粒體基因組的J鏈。核苷酸保守性較低的tRNA基因主要是tRNA-V和tRNA-F(%INUC<37)，其中tRNA-V的保守性最低；上述這些核苷酸保守性較低的tRNA基因均位于線粒體基因組的N鏈。

表3 基于22個(gè)tRNA基因科間遺傳距離Table 3 The inter-family distance (K2P) of 22 tRNA

注：*代表各個(gè)總科內(nèi)的遺傳距離。

Note: *represents the genetic distance within each superfamily.

圖2 tRNA同源基因相同核苷酸百分比(%INUC)Fig.2 Percent of identical nucleotides of homeotic tRNA gene

上述蝎蝽次目昆蟲線粒體tRNA基因序列的保守性反映在其二級(jí)結(jié)構(gòu)上如圖3所示。在蝎蝽次目12種內(nèi)tRNA莖表現(xiàn)為較高的保守性，而環(huán)中除了反密碼子環(huán)相對(duì)保守外，其余環(huán)都有不同程度的堿基變異。幾乎每一個(gè)同源tRNA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)非經(jīng)典G-U配對(duì)，G-U配對(duì)于維系tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性非常重要。在蝎蝽科的二級(jí)結(jié)構(gòu)上標(biāo)記11科12種的保守點(diǎn)，具體表現(xiàn)為：tRNA-L2的氨基酸接受莖保守性較高(長(zhǎng)度均為7 bp，其中只有3個(gè)堿基表現(xiàn)為不保守)，D莖保守性極高(長(zhǎng)度均為3 bp，所有堿基全部保守)，反密碼子莖保守性極高(長(zhǎng)度除仰泳蝽科Notonectidae sp.為4 bp外，其余均為5 bp，只有1個(gè)堿基不保守)，TψC莖保守性極高(長(zhǎng)度除仰泳蝽科Enitharestibialis為4 bp外，其余均為5 bp，所有堿基全部保守)。而在tRNA-L2的D環(huán)，反密碼子環(huán)，可變環(huán)和TψC環(huán)4個(gè)環(huán)中只有反密碼子環(huán)保守性較高(長(zhǎng)度除仰泳蝽科Notonectidae sp.為9 bp外，其余均為7 bp，只有2個(gè)堿基不保守)，而在其余3個(gè)環(huán)中存在較多變異位點(diǎn))。

tRNA-V的氨基酸接受莖保守性極低(長(zhǎng)度均為7 bp，保守的堿基數(shù)為4)，D莖保守性極低(在仰泳蝽科Enitharestibialis和 Notonectidae sp.中長(zhǎng)度變異較大)，反密碼子莖保守性相對(duì)高些(長(zhǎng)度均為5 bp，保守堿基數(shù)為6)，TψC莖保守性極低(在劃蝽科Sigaraseptemlineata和仰泳蝽科Notonectidae sp.長(zhǎng)度變異為4 bp，其余科的長(zhǎng)度均為5 bp，保守的堿基數(shù)為3)。而在tRNA-V的D環(huán)，反密碼子環(huán)，可變環(huán)和TψC環(huán)4個(gè)環(huán)中只有反密碼子環(huán)保守性較高(長(zhǎng)度均為7 bp，保守堿基數(shù)為5 bp)。

由二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析得出：氨基酸接受莖保守性高(不保守的堿基數(shù)為3或4)的tRNA有tRNA-L2、tRNA-Q、tRNA-K、tRNA-T、tRNA-N，D莖保守性高(全部堿基保守)的tRNA有tRNA-L2、tRNA-T、tRNA-N、tRNA-W、 tRNA-P，反密碼子莖保守性高(全部堿基保守或只有一個(gè)堿基不保守)的tRNA有tRNA-L2、tRNA-Y、tRNA-M、tRNA-K、tRNA-A，TψC莖保守性高(全部堿基保守)的tRNA有tRNA-L2，其余tRNA的TψC 莖保守性均較低。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，基于ML(圖4)和BI(圖5)算法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果基本一致，固蝽總科、仰泳蝽總科和劃蝽總科均為單系，其中固蝽總科和仰泳蝽總科為姐妹群關(guān)系，其余總科的單系性沒有得到很好的解析，可能與tRNA基因序列相似度較高，能夠提供的有效系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)較少有關(guān)。蟾蝽總科中的蜍蝽科和蝎蝽總科中的蝎蝽科為姐妹群關(guān)系，蟾蝽總科中的蟾蝽科和潛蝽總科中的潛蝽科為姐妹群關(guān)系，潛蝽總科中的蓋蝽科與固蝽總科和仰泳蝽總科形成的支系為姐妹群。

3 討論與結(jié)論

線粒體tRNA基因作為攜帶并轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸功能的一類小分子核糖核酸，在蛋白質(zhì)翻譯過程中起著非常重要的作用，目前關(guān)于線粒體tRNA 研究中較多的是其一級(jí)結(jié)構(gòu)核苷酸序列應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究分析中及對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[11～15]。本研究獲得蝎蝽次目11科所有12個(gè)種的22個(gè)tRNA，其排列位置與果蠅Drosophilayakuba[16]的相同。通過對(duì)tRNA的堿基組成分析發(fā)現(xiàn)，12個(gè)物種的A+T%含量在70%～80%之間，呈現(xiàn)明顯的AT偏好性，通常昆蟲線粒體基因組中A+T%的含量高于G+C%[17]。12個(gè)代表種堿基A和T的含量均高于G和C，其中除了Helotrephessp. 和DiplonychusrusticusT稍高于A之外，其余種A均高于T，所有種G均高于C，呈現(xiàn)了明顯的AT偏斜和GC偏斜，而大多數(shù)昆蟲線粒體基因組中A的含量高于T, C的含量高于G[18]，呈現(xiàn)AT偏斜和CG偏斜。本研究中tRNA基因呈現(xiàn)的GC偏斜與大多數(shù)昆蟲線粒體基因組呈現(xiàn)的CG偏斜不一致。堿基組成的偏好性一般被認(rèn)為是由于四種堿基不對(duì)稱的突變和選擇壓力所導(dǎo)致的，主要來自復(fù)制和基因的轉(zhuǎn)錄。Wei[19]結(jié)合基因組復(fù)制起點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及線粒體基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄方式的分析，發(fā)現(xiàn)GC之間的相對(duì)含量與復(fù)制起點(diǎn)的方向相關(guān)，而AT之間的相對(duì)含量因復(fù)制起點(diǎn)方向、基因方向以及密碼子位置的變化而改變。因而，堿基組成的偏向性對(duì)研究線粒體基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的機(jī)理具有重要參考價(jià)值。

圖5 基于22個(gè) tRNA基因構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(分支節(jié)點(diǎn)內(nèi)數(shù)字代表節(jié)點(diǎn)支持率)Fig.5 Phylogenetic tree inferred from 22 tRNA genes constructed using BI analysis

通過比較蝎蝽次目11科12種22個(gè)tRNA基因序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)差異可以看出，不同線粒體tRNA基因間以及同一基因不同區(qū)域內(nèi)的核苷酸變異均存在顯著多態(tài)性，不同物種的同源tRNA均使用相同的反密碼子。22個(gè)tRNA基因中，tRNA-L2的變異位點(diǎn)數(shù)最少，保守性最高，占核苷酸總數(shù)的73%以上；tRNA-V的變異位點(diǎn)數(shù)最多，保守性最低，占核苷酸總數(shù)的34%以下?？崎g莖區(qū)序列變化較少，其中D莖最為保守而TψC莖變異相對(duì)較多；環(huán)區(qū)變異速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于莖區(qū)，變異主要發(fā)生在D環(huán)和TψC環(huán)，而反密碼子環(huán)十分保守，且不同物種的同源tRNA均使用相同的反密碼子，可能與其行使轉(zhuǎn)譯功能有關(guān)。tRNA基因進(jìn)化主要是以堿基替換為主[20]，莖區(qū)比環(huán)區(qū)保守性更高，可能是由于線粒體tRNA 基因莖區(qū)和環(huán)區(qū)受到的選擇壓力不同，莖區(qū)序列為維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化較慢而環(huán)區(qū)變化較快的結(jié)果[21～23]。

基于ML和BI算法的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果基本一致，顯示固蝽總科和仰泳蝽總科為姐妹群關(guān)系，這一觀點(diǎn)在Li[3]和Zhang[4]中都得到了證實(shí)。其余總科的單系性并未得到很好的解析，可能與tRNA基因序列過短，能夠提供的信息量十分有限有關(guān)。在今后的研究中，仍需加入大量的基因序列來確定蝎蝽次目各總科及科間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。關(guān)于線粒體tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征在蝎蝽次目乃至異翅亞目類群的分類進(jìn)化中的適用性以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系方面有待于做進(jìn)一步的研究。