杜亞麗，徐凱，龍登隆，李新宇，王春梅，蘭俊，趙慧婷，姜玉鎖*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

昆蟲嗅覺識別過程需要多種蛋白的參與，其中嗅覺受體(olfactory receptors，ORs)能夠介導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)(包括各種信息素和植物性氣味)與嗅覺神經(jīng)元(olfactoty sensory neurons，OSNs)的特異性結(jié)合，對于配偶、同伴、食物和產(chǎn)卵場所的選擇至關(guān)重要[1]。中華蜜蜂(Apisceranacerana)是我國特有的當(dāng)家蜂種，具有敏銳的嗅覺和較強(qiáng)的抗逆能力，善于搜尋零散的蜜粉源，適于在我國的高寒山區(qū)進(jìn)行定地飼養(yǎng)[2]。研究中華蜜蜂普通嗅覺受體有利于我們進(jìn)一步了解中華蜜蜂的氣味識別機(jī)制，為其科學(xué)飼養(yǎng)管理提供新的理論指導(dǎo)。昆蟲ORs在嗅覺神經(jīng)元樹突膜上特異性表達(dá)，一般由300～450個氨基酸組成，含有7個α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域，N-末端在細(xì)胞膜內(nèi)，C-末端在細(xì)胞膜外，這與脊椎動物的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCR)的膜拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)相反。目前已在鱗翅目、雙翅目、膜翅目和鞘翅目等多種昆蟲中鑒定出了嗅覺受體基因。其中，從膜翅目昆蟲西方蜜蜂Apismellifera[3]、麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis[4]、阿根廷蟻Linepithemahumile[5]、紅色收獲蟻Pogonomyrmexbarbatus[6]、佛羅里達(dá)弓背蟻Camponotusfloridanus[7]、印度跳蟻Harpegnathossaltator[8]、東方蜜蜂Apiscerana[9]、小蜜蜂Apisflorea[10]、蘭州熊蜂Bombuslantschouensis[11]中分別篩選獲得了170、301、367、344、407、377、119、180、165個ORs。昆蟲的嗅覺神經(jīng)元通常表達(dá)兩類嗅覺受體：一類是傳統(tǒng)嗅覺受體ORs，該類受體主要用于識別普通氣味分子和信息素，其同源性較低，僅在少部分嗅覺神經(jīng)元中低豐度表達(dá)。另一類是非典型嗅覺受體Orco(olfactory receptor co-receptor)，該類受體不能直接識別氣味，但是可以協(xié)助ORs精確定位到神經(jīng)元樹突膜上而提高ORs對氣味分子的敏感性，其高度保守，在大多數(shù)神經(jīng)元中均有表達(dá)。按配體結(jié)合差異特性又將ORs分為識別普通揮發(fā)性氣味分子的普通嗅覺受體(general olfactory receptors)和識別性信息素的性信息素受體(pheromone receptors)兩類。在對岡比亞按蚊Anophelesgambiae、煙芽夜蛾Heliothisvirescens和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的研究中發(fā)現(xiàn)，缺失Orco后會降低昆蟲對氣味的敏感性，重新導(dǎo)入后又逐漸恢復(fù)正常[12]。ORs通常與Orco以異源二聚體的形式組成一個配體門控離子通道，將環(huán)境中的小分子化學(xué)信息物質(zhì)所攜帶的信息轉(zhuǎn)化為電信號，刺激嗅覺神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位并傳至腦部的觸角葉，使昆蟲感知到外界氣味進(jìn)而做出相應(yīng)的行為反應(yīng)。不同ORs對不同類氣味的反應(yīng)譜也不同。例如，意大利蜜蜂AmelOR11在雄蜂中表達(dá)并特異性地識別反式-9-氧代-癸二烯酸(9-ODA)[13]，綠盲蝽AlucOR40只對反-2-己烯醇有特異性反應(yīng)[14]，小菜蛾P(guān)xylOR9只對植物揮發(fā)物β-紫羅蘭酮的刺激具有反應(yīng)[15]，而黑腹果蠅DmelOR67能被大多數(shù)氣味分子激活[16]，豆桿野螟OscaOR3對種內(nèi)和近緣種的性信息素都有反應(yīng)[17]，中華蜜蜂AcerOR1能廣泛地識別丁香酚、月桂酸、橙花醇等9種花香物質(zhì)[18]。不同昆蟲普通嗅覺受體基因間的同源性比較低，使用同源克隆技術(shù)很難獲得目的基因序列，而目前對中華蜜蜂普通嗅覺受體的研究報道還相對較少?？寺～@得了AcerOR141的cDNA序列，并對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，明確其在工蜂不同發(fā)育階段各組織中的mRNA表達(dá)情況，為中華蜜蜂普通嗅覺受體的功能研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用中華蜜蜂A.c.cerana于2018年5-7月份在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場進(jìn)行樣本的標(biāo)記及收集工作。選擇群勢較強(qiáng)、健康無病的正常蜂群，抽出2張成熟的封蓋子脾(可看到有正在出房的新蜂)置于恒溫培養(yǎng)箱中(T(34±1) ℃；RH(75±5)%)。次日，使用專用記號筆在新蜂背部進(jìn)行標(biāo)記(約3 000只)，20 min后放回原來的蜂群。剛出房的新蜂記為1日齡，之后每5 d采一次樣，每次270只，隨機(jī)分為3組，分離觸角、頭(去除觸角)、胸(去除足和翅膀)、腹、足和翅膀等組織，迅速投入液氮冷凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與試劑盒

TRIzol?Reagent購自美國Invitrogen公司；克隆載體pGEM?-T Easy，化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞JM109和凝膠回收試劑盒Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System購自美國Promega公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，RNase-free water，SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)和DL 2000 DNA Marker購自日本Takara公司；2×Easy Taq PCR SuperMix(-dye)和GelStain購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；酵母粉和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司；50×TAE Buffer，Ampicillin，IPTG，X-Gal和固相清除劑等試劑均購自北京EBT生物公司；甲醇、無水乙醇、異丙醇、氯仿等分析純購自天津天力化學(xué)試劑有限公司。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

參照TRIzol試劑說明書提取1.1中收集的成蜂不同發(fā)育階段各組織的總RNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳和ND-1000(NanoDrop，美國)進(jìn)行質(zhì)量和濃度測定。以1 μg總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，測定濃度后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析得到的Unigene序列，利用Primer 3.0 plus在線程序(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增目的基因序列的引物；根據(jù)分析獲得的ORF序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)用于qRT-PCR的特異性引物。內(nèi)參基因?yàn)镹CBI上獲得的AcerArp1(HM640276.1)。引物詳細(xì)信息見表1。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

1.5 基因克隆

以中華蜜蜂觸角cDNA為模板，使用2×Easy Taq PCR SuperMix(-dye)，在ABI VeritiTM96 well PCR system中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序設(shè)定為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，X ℃(退火溫度X詳見表1)30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增循環(huán)35次；72 ℃ 8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖電泳分離后，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行目的片段的回收，將其連接到pGEM?-T Easy載體后進(jìn)行雙向測序(由北京華大基因科技有限公司完成)。

1.6 序列分析

使用EditSeq工具查找并翻譯AcerOR141的ORF區(qū)，運(yùn)用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析AcerOR141的基本理化性質(zhì)；TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測該蛋白的跨膜區(qū)域；SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)查找含有的信號肽序列；Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析存在的保守區(qū)域；CBS Prediction Servers(http://www.cbs.dtu.dk/services/)分析潛在的糖基化和磷酸化位點(diǎn)；SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析功能結(jié)構(gòu)域；CELLULAR(https://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。將其編碼的氨基酸序列導(dǎo)入在線軟件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。Blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找同源的氨基酸序列后，使用MEGA6.0軟件中的ClustalW比對氨基酸序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootrap值為1 000。

1.7 AcerOR141表達(dá)量的檢測

以1.3中獲得的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測。qRT-PCR反應(yīng)體系包括：SYBR?Premix Ex TaqTMII(2×)7.5 μL，上、下游引物(10 μM)各0.6 μL，cDNA模板100 ng，ROX Reference Dye II(50×)0.3 μL，ddH2O補(bǔ)至15 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；接著進(jìn)行45個循環(huán)：95 ℃ 30 s，62 ℃ 34 s。每個樣品進(jìn)行3次平行。應(yīng)用MXPro-MX3000P軟件分析標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增曲線的Ct值，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。通過SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，接著采用Duncan′s法進(jìn)行多重比較，最后利用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆與測序分析

用設(shè)計(jì)的引物對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增(圖1)，隨后進(jìn)行克隆和測序。利用DNAStar軟件中的SeqMan工具拼接測序結(jié)果，獲得的cDNA序列全長為1 657 bp，包括303 bp的5′非編碼區(qū)(5′UTR)、1 299 bp的完整開放閱讀框(ORF)和55 bp的3′非編碼區(qū)(3′UTR)，共編碼432個氨基酸(圖2)。經(jīng)Blastp比對發(fā)現(xiàn)，推測的氨基酸序列與西方蜜蜂AmelOR141一致性為91%，因此確定該序列為中華蜜蜂AcerOR141基因，并提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(GenBank登錄號為：KT246483.1。)

圖1 AcerOR141基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of AcerOR141 注：M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2和3泳道分別為720、405、1 063 bp。Note：M, DNA Marker; Lane 1, 2 and 3 are 720, 405 and 1 063 bp, respectively.

2.2 理化特性和結(jié)構(gòu)分析

ExPASy ProtParam在線分析表明，AcerOR141蛋白分子式為C2259H3533N563O624S24，分子量大小為49.33 kDa，理論等電點(diǎn)為8.74，為堿性蛋白。在組成AcerOR141蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，達(dá)12.3%；色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)所占比例最低，為1.6%；帶正、負(fù)電荷的氨基酸總數(shù)分別為40和33?？偲骄H水性系數(shù)、脂溶指數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)分別為0.306、106.06、37.07，表明AcerOR141是一種穩(wěn)定的脂溶性蛋白。

AcerOR141蛋白無信號肽，具有7個跨膜結(jié)構(gòu)，分別位于第37～59，69～91，130～152，208～230，309～331，341～363，406～428位氨基酸之間，且N端位于胞內(nèi)，C端位于胞外(圖3)。該蛋白的氨基酸序列中，第184～421位間有一個昆蟲嗅覺受體7tm-6 superfamily的保守結(jié)構(gòu)域(E值：1.00e-29)。AcerOR141氨基酸序列中不含有O-糖基化位點(diǎn)，但存在4個潛在的N-糖基化位點(diǎn)，為第61、64、164和322位的天冬酰胺(Asn)殘基；含有15個潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括7個蘇氨酸殘基(Thr6,124, 222, 268, 274, 308, 334)、3個酪氨酸殘基(Tyr199, 340, 378)和5個絲氨酸殘基(Ser119, 240, 272, 279, 319)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，AcerOR141為細(xì)胞質(zhì)膜蛋白(Plasma Membrance)的可能性為0.997。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，AcerOR141編碼的蛋白以α-螺旋(helix)為主，占68.52%；β-折疊(strand)和卷曲環(huán)(coil loop)所占比例分別為28.94%和2.55%。

2.3 序列比對和進(jìn)化樹分析

利用Blastp找到與AcerORs同源蛋白的氨基酸序列，其中，AmelOR141和AmelOR13a-like的氨基酸序列一致性為99%，蛋白結(jié)構(gòu)相似，應(yīng)該為同一個基因。中華蜜蜂與其它膜翅目昆蟲的ORs氨基酸序列一致性差異較大，在43%～97%之間。從圖4可以看出，所有膜翅目的ORs分為兩大分支：即蜜蜂科的中華蜜蜂AcerOR141、西方蜜蜂AmelOR141和AmelOR13a-like、大蜜蜂AdorOR56a-like、小蜜蜂AfloOR85e、熊蜂BimpOR49b-like、地熊蜂BterOR13a、回條蜂HlabOR13a-like、蘆蜂CcalOR49b-like與苜蓿切葉蜂MrotOR92a為一大分支；蟻科的牛角刺槐蟻PgraOR49b-like、北方粗切葉蟻TsepOR49b-like、佛羅里達(dá)弓背蟻CfloOR13a、育菌蟻CcosOR49b-like和紅色收獲蟻PbarOR49b-like聚為另一大分支。

圖2 AcerOR141基因cDNA和氨基酸序列Fig.2 cDNA and amino acid sequences of AcerOR141 注：紅色方框表示起始和終止密碼子，紅色下劃線表示跨膜區(qū)，箭頭方向表示膜內(nèi)。TMD1-7：跨膜結(jié)構(gòu)域1-7。Note: The start and stop codons are shown by the red box; the transmembrane regions are indicated by a red line down the sequences; the direction of arrowheads represents the inside of membranes. TMD1-7, the number of transmembrane region.

圖3 AcerOR141跨膜區(qū)域預(yù)測圖Fig.3 AcerOR141 transmembrane region prediction

2.4 AcerOR141基因時空表達(dá)分析

工蜂羽化出房后不同日齡各組織中AcerOR141 mRNA的表達(dá)情況見圖5。綜合各發(fā)育階段的組織特異性分布模式可發(fā)現(xiàn)，AcerOR141 mRNA在工蜂觸角和頭部的表達(dá)量較高，且極顯著高于其他組織(胸、腹、足和翅膀)(P<0.01)，在其它組織中僅有微量的表達(dá)。1、15、25和30日齡工蜂觸角中AcerOR141的表達(dá)量最高，極顯著高于其它組織(P<0.01)；頭部的表達(dá)量次之，其余組織之間無明顯差異(P>0.05)。5、10和20日齡工蜂頭部的表達(dá)量最高，觸角次之，均極顯著高于其它組織(P<0.01)。觸角和頭部不同日齡的表達(dá)模式(圖5)顯示，AcerOR141在不同日齡的表達(dá)量差異較大。工蜂頭部的表達(dá)量在1日齡時較低，之后大幅上調(diào)，5日齡達(dá)到最高，隨后又逐漸下降，20日齡緩慢增加，之后又突然下降，與1日齡表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。觸角的表達(dá)趨勢與之基本一致，變化幅度較小，且10日齡表達(dá)量達(dá)到最高，極顯著高于其它日齡(P<0.01)。

圖4 幾種膜翅目昆蟲ORs的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ORs from several Hymenoptera insects 注：各蛋白的來源、登錄號The source and accession number of various protein sequence: AcerOR141, 中華蜜蜂Apis cerana cerana (ALR87041.1); AmelOR141, 西方蜜蜂Apis mellifera (Robertson and Wanner, 2006); AdorOR56a-like, 大蜜蜂Apis dorsata (XP_006608157.1); AmelOR13a-like (XP_006563645.1); AfloOR85e, 小蜜蜂Apis florae (XP_012339623.1); BimpOR49b-like, 熊蜂Bombus impatiens (XP_003486905.2); BterOR13a, 地熊蜂Bombus terrestris (XP_003401155.2); HlabOR13a-like, 回條蜂Habropoda laboriosa (XP_017796563.1); CcalOR49b-like, 蘆蜂Ceratina calcarata (XP_017889358.1); MrotOR92a, 苜蓿切葉蜂Megachile rotundata (XP_003705978.2); PgraOR49b-like, 牛角刺槐蟻Pseudomyrmex gracilis (XP_020293473.1); TsepOR49b-like, 北方粗切葉蟻Trachymyrmex septentrionalis (XP_018356899.1); CfloOR13a, 佛羅里達(dá)弓背蟻Camponotus floridanus (XP_011252458.2); CcosOR49b-like, 育菌蟻Cyphomyrmex costatus (XP_018407571.1); PbarOR49b-like, 紅色收獲蟻Pogonomyrmex barbatus (XP_011639928.1).

3 討論

一般認(rèn)為，昆蟲嗅覺受體ORs的典型結(jié)構(gòu)特征是含有7個α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域，但不屬于G蛋白偶聯(lián)受體。在實(shí)驗(yàn)室前期中華蜜蜂觸角轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究克隆得到了嗅覺受體基因AcerOR141的全長序列。生物信息學(xué)分析表明，AcerOR141編碼432個氨基酸，無信號肽序列，具有7個跨膜結(jié)構(gòu)且N-端位于胞內(nèi)。這與棉鈴蟲HarmOR29[19]、小菜蛾P(guān)xylOR17[20]、綠盲蝽AlucOR40[14]、中華蜜蜂AcerOR2[21]、AcerOR10[22]和AcerOR35[23]的預(yù)測結(jié)果相一致，因此我們可以確定AcerOR141為中華蜜蜂的嗅覺受體基因。序列比對和進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示蜜蜂科和蟻科嗅覺受體序列保守性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與嗅覺受體具有多樣性和物種特異性的特征是一致的。

圖5 AcerOR141在工蜂不同發(fā)育階段、不同組織中的差異性表達(dá)Fig.5 The differential expression of AcerOR141 at different developmental stages and in different tissues of workers 注：An，觸角；H，頭(去除觸角)；T，胸(去除足和翅膀)；Ab，腹；L，足；W，翅膀；1 d～30 d：成年工蜂的日齡。柱上不同大寫字母表示同一日齡工蜂不同組織間AcerOR141 mRNA的表達(dá)差異極顯著(P<0.01)，小寫字母表示工蜂同一組織不同日齡間AcerOR141 mRNA的表達(dá)差異極顯著(P<0.01)。Note: An: Antenna; H: Head without antenna; T: Thorax without legs and wings; Ab: Abdomen; L: Legs; W: Wings; 1 d～30 d: day-ages of adult worker bees. Significant difference at 0.01 level in the expression of AcerOR141 mRNA between tissues of same day-ages was shown by different upper-case, and significant difference in the expression of AcerOR141 mRNA in antenna and head between day-ages was shown by different lower-case.

在生物體內(nèi)，翻譯得到的蛋白需要進(jìn)行不同的修飾加工，修飾方式調(diào)控著蛋白質(zhì)的生物功能。N-糖基化修飾是一種新生肽鏈的共翻譯或翻譯后修飾方式，將糖鏈與天冬酰胺的自由基-NH2基連接，可顯著增加蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過程中起重要作用[24]。AcerOR141含有的4個N-糖基化位點(diǎn)可能會增加AcerOR141的構(gòu)象穩(wěn)定性，改變其生物活性。此外，蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活性和生物功能的一種普通的調(diào)節(jié)方式，在酶的催化作用下將磷酸基團(tuán)連接到底物蛋白質(zhì)的絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸上，在細(xì)胞信號傳遞過程中發(fā)揮著重要作用[25]。AcerOR141包含15個潛在的磷酸化位點(diǎn)，這可能與嗅覺識別過程中電生理信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

昆蟲基因的表達(dá)模式在一定程度上能夠反映其相應(yīng)的生物學(xué)功能[26]。性信息素受體一般在雄蟲觸角中特異性高表達(dá)，而普通嗅覺受體的表達(dá)分布范圍較廣。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示，工蜂觸角和頭中AcerOR141 mRNA的表達(dá)量均極顯著高于其他組織(P<0.01)，這說明AcerOR141可能屬于普通嗅覺受體。嗅覺受體表達(dá)于嗅覺感器神經(jīng)元內(nèi)，而觸角是昆蟲重要的嗅覺器官，其上密布著豐富的嗅覺感器[1]，因此，AcerOR141在觸角中高表達(dá)與其推測的嗅覺受體的生理功能是一致的。本課題組前期研究的中華蜜蜂AcerOR1、AcerOR35、AcerOR96、AcerOR113和AcerOR167均在工蜂觸角中特異性高表達(dá)[23, 27～29]。此外，昆蟲頭部的口器附肢表面也分布著大量的感覺器，內(nèi)部有腦、消化道前端、與附肢相關(guān)的肌肉和神經(jīng)等，是昆蟲重要的感覺和攝食中心[30]。中紅側(cè)溝繭蜂MmedOR6和MmedOR10在觸角、頭和足中均有表達(dá)，可能參與棲息場所選擇和天敵躲避等行為[31]。小菜蛾P(guān)xylOR16、PxylOR17和PxylOR18除觸角之外，在頭、下唇須和喙中有較高的表達(dá)，推測其能夠識別普通氣味物質(zhì)[20]。致倦庫蚊CquiOR118高表達(dá)于雌蚊頭部，可能參與宿主的搜尋、定位等行為[32]。中華蜜蜂AcerOR141在頭部也有相對較高的表達(dá)，推測其可以用頭部來感受外界環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)。

工蜂承擔(dān)蜂群內(nèi)除繁殖以外的所有工作，且根據(jù)日齡的不同進(jìn)行明確的勞動分工。一般來說，1～3日齡的幼蜂主要從事清理巢房和封蓋幼蟲的工作；4～12日齡主要承擔(dān)照顧蜂王和幼蟲、調(diào)制日糧等工作；13～18日齡主要進(jìn)行泌蠟造脾的工作，后期的主要任務(wù)是巢門防守；19～21日齡之后開始出巢采集花粉、花蜜、水和樹膠等，稱為采集蜂[33]。本研究發(fā)現(xiàn)25和30日齡采集蜂頭部中AcerOR141的表達(dá)量較低，極顯著低于觸角(P<0.01)，這可能與采集蜂主要參與外出采集工作，生理上逐漸發(fā)生退化，腦部出現(xiàn)氧化損傷、神經(jīng)元減退等現(xiàn)象，嗅覺記憶功能顯著喪失密切相關(guān)[34]。

4 結(jié)論

本研究成功獲得了中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOR141 cDNA序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明AcerOR141具有昆蟲嗅覺受體的典型特征。時空表達(dá)結(jié)果顯示，AcerOR141 mRNA在工蜂觸角和頭部的表達(dá)較高，極顯著地高于其他組織(P<0.01)，在胸、腹、足和翅膀中僅有微量的表達(dá)，暗示該基因?qū)儆谄胀ㄐ嵊X受體，其可能在普通氣味組分的識別過程中發(fā)揮重要作用，具體功能還有待進(jìn)一步研究。