高仕杰，石家曉，李波

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院骨科 (天津 300052)

脊髓損傷是一種嚴重的、致殘率較高的疾病。目前針對脊髓損傷的修復研究面臨許多困難，如神經(jīng)元的凋亡、機械屏障的生成、神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺失、抑制軸突再生的因素等。不同學者嘗試用不同方法克服以上困難。本研究就修復藥物Nafamostat修復脊髓損傷的效果進行綜述。

1 脊髓損傷后的微環(huán)境改變

脊髓損傷宏觀上是指外傷或者退行性病變等原因?qū)е碌募顾鑹浩燃笆軗p，為脊髓損傷的第一階段。在此基礎上，進一步引起鏈式反應，即第二階段，各種分子病理機制陸續(xù)產(chǎn)生，如離子穩(wěn)態(tài)的失調(diào)、局部水腫、缺血、局部出血、氧化應激及細胞凋亡，在脊髓損傷的惡化過程中，它們起著重要的作用，為此引出了一個新的定義：脊髓損傷微環(huán)境。

脊髓損傷微環(huán)境受脊髓及脊髓周圍的各種細胞和相關因子同時影響。膠質(zhì)瘢痕，是繼發(fā)性脊髓損傷后的標志，可將損傷中心與正常的脊髓組織分離開來。膠質(zhì)瘢痕由反應性星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞前體細胞、小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞內(nèi)皮細胞、成纖維細胞，以及這些細胞的細胞外基質(zhì)混合而成。反應性星形膠質(zhì)細胞，是脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕的標志性細胞。目前反應性星形膠質(zhì)細胞的啟動、維持和遷移的機制已經(jīng)逐漸被發(fā)現(xiàn)。在許多細胞外因子中，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白細胞介素-1(IL-1)和干擾素-γ(IFN-γ)已經(jīng)被證明可以觸發(fā)星形膠質(zhì)細胞重新激活，mTOR-STAT3信號通路和BMP-mir-21軸也同樣被證明對于反應性星形膠質(zhì)細胞的基因表達譜至關重要。干擾這些信號傳導中的任何一個都可以顯著減少脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕的形成。反應性星形膠質(zhì)細胞在脊髓損傷中是一把雙刃劍，在脊髓損傷早期，膠質(zhì)瘢痕的形成起到一定的優(yōu)勢作用，其可以將炎癥介質(zhì)局限在一定的范圍內(nèi)，限制病灶的擴張，減少正常組織的受損，促進血管生成和血腦屏障的再建，為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持。然而在損傷過程中后期，膠質(zhì)瘢痕則成為神經(jīng)元軸突途徑中的重大阻礙?；谶@一病理機制，脊髓損傷中后期抑制瘢痕形成，可以促進脊髓修復。

2 Nafamostat的作用機制

Nafamostat，別名Nafamostat Mesylate，分子式C19H17N5O2·2CH4O3S，是一種合成的蛋白酶抑制藥，上市于日本，廣泛地用于胰腺炎和彌散性血管內(nèi)凝血患者的治療[1]，還可作為血液透析的抗凝血劑。其臨床應用取決于其對各種類型的絲氨酸蛋白酶(包括凝血酶因子Ⅸ,Ⅹ,Ⅻa,and Ⅶa)的活性抑制作用[2]。

目前，對Nafamostat的研究很多，從臨床應用到實驗研究，人們不斷挖掘Nafamostat在疾病治療中的潛力，并且進一步探尋其在疾病發(fā)展至治愈階段的作用機制。目前的基礎實驗研究表明，在膿毒性休克、心臟缺血再灌注損傷、移植物排斥反應和急性炎性疾病等多種病理條件下，一氧化氮(NO)或過氧亞硝酸鹽的產(chǎn)生與組織損傷有關[3]。在病理機制中NO參與了多種細胞類型的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的激活，包括人軟骨細胞、大鼠系膜細胞、人中性粒細胞和人血小板。MMPs的上調(diào)則可導致細胞外基質(zhì)降解、炎性細胞外滲、血管生成和血小板聚集。Nafamostat可以明顯抑制NO的合成、炎癥反應的產(chǎn)生和細胞的凋亡[4]。這是由于Nafamostat的分子結(jié)構(gòu)中具有胍基，這一結(jié)構(gòu)特性使得Nafamostat可以競爭性抑制NO合成酶或者破壞其活性，從而影響NO的合成。同時，它還可以抑制由脂多糖(LPS)誘導的轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)，從旁路抑制NO合成酶的產(chǎn)生[5]。此外，Nafamostat還可以減少由LPS誘導的白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)[6]。眾所周知，IL-8是激活多形核白細胞、增加血管通透性和誘導炎性新生血管的有力因子之一，IL-6是引起傳染病中血小板增多的因子。Nafamostat還可以抑制炎癥反應和微循環(huán)中血栓的形成。

Nafamostat在腦組織損傷修復方面也有相應的研究。有報道表明，血腦屏障(BBB)的破壞將導致腦水腫和出血，是腦卒中發(fā)病的重要因素[7]?，F(xiàn)在越來越多的人支持這一理論，因此腦缺血后BBB損傷的減輕被認為可對神經(jīng)進行保護。據(jù)報道，缺血性腦卒中后，在損傷的脈管系統(tǒng)，特別是缺血組織周圍血管處凝血酶水平增加，進一步激活內(nèi)皮細胞凝血酶受體1(PAR1)而誘導內(nèi)皮功能障礙[8]，調(diào)高蛋白激酶Ca(PKCa)的活性[9]，還可以使內(nèi)皮RhoA活化[10]，這3點共同導致BBB完整性的破壞，意味著局部缺血和凝血酶是損傷血腦屏障的重要原因[11]。BBB由眾多的細胞和結(jié)構(gòu)組成，包括內(nèi)皮細胞、基底膜、星形膠質(zhì)細胞和周圍細胞，是由相鄰內(nèi)皮細胞的緊密連接及相關蛋白聯(lián)合作用形成，特別是緊密連接蛋白閉合蛋白和閉鎖小帶蛋白1(ZO-1)，其表達水平的高低直接影響內(nèi)皮屏障的通透性[12]。PKC是一種家族蛋白，主要通過磷酸化蛋白的絲氨酸和蘇氨酸氨基酸殘基的羥基，參與控制該蛋白的功能，進而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導，PKC家族中PKCa在內(nèi)皮細胞滲透性的調(diào)整上起著一定的作用。RhoA，參與多種細胞程序，包括內(nèi)皮細胞屏障的完整性和功能的調(diào)節(jié)[13]。大量數(shù)據(jù)表明，凝血酶可以促進RhoA連接其下游作用因子Rho-激酶，進而導致肌球蛋白輕鏈(MLC2)磷酸化和肌動蛋白纖維的形成，從而使BBB的滲透性隨之提高[14]。此外，RhoA的激活已被證明與緊密連接蛋白狀態(tài)有關[15]。為了證明Nafamostat對腦組織修復的有效性，采用動物體內(nèi)及體外實驗進行驗證，經(jīng)過Nafamostat處理過的大鼠，閉合蛋白和ZO-1的表達水平得到了提高，PKCa磷酸化的水平未見明顯增長，并減緩了Rho活性的增加，以及MLC2磷酸化和肌動蛋白纖維的形成。表明Nafamostat可通過抑制凝血酶減輕BBB的損害，進一步證明了Nafamostat可通過PKCa/RhoA/p-MLC2發(fā)揮作用，保護BBB完整性[16]。

隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，人們的研究領域也在不斷拓寬，對于腦損傷后神經(jīng)的修復，不再局限于凝血酶、炎癥介質(zhì)，而是從細胞整體功能的研究，逐漸拓展到細胞器功能的探索。已有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是促進凋亡信號和感知腦損傷的關鍵成分，在缺血誘導的神經(jīng)元變性中起關鍵作用[17]。例如，缺血/再灌注損傷可誘導神經(jīng)元在缺血區(qū)的凋亡和上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物的表達，包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)[18]。GRP78作為一個良性標志物，可以減少對CHOP的誘導、細胞的凋亡并阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應激[19]。在短暫大腦中動脈閉塞(MCAO)的實驗中，Nafamostat抑制了CHOP的表達，還可通過抑制小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化增強神經(jīng)細胞中GRP78的表達[20]。文獻[21]報道，CHOP的誘導主要通過未折疊的蛋白反應調(diào)控PERK-eIF2α-ATF4信號通路進行，我們檢測出在MCAO組中eIF2α表達上調(diào)，應用藥物治療后eIF2α表達受抑制，進一步證明了Nafamostat主要是抑制eIF2α來調(diào)控CHOP[20]。

以上實驗均證實了Nafamostat是一種很有潛力的藥物，可以治療缺血性腦卒中及修復神經(jīng)元的損傷。

3 Nafamostat在脊髓損傷修復中的應用

有報道證明Nafamostat可增加同側(cè)海馬、對側(cè)和同側(cè)感覺運動皮層腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)的表達，激活TrkB/ERK1/2-CREB信號通路，抑制同側(cè)海馬和對側(cè)感覺運動皮質(zhì)的Cdk 5活性，但不影響JNK和p38 MAPK的磷酸化。通過這些通路傳導及各類因子的釋放，對側(cè)皮質(zhì)紅核束和皮質(zhì)脊髓束中的纖維數(shù)目得以增加，同樣延長了皮質(zhì)脊髓束纖維的總長度，同時增加了對側(cè)感覺運動皮質(zhì)生長相關蛋白43(GAP-43)蛋白水平的表達。這些結(jié)果提示，Nafamostat能促進損傷對側(cè)皮質(zhì)軸突再生，并支配同側(cè)紅核和脊髓運動神經(jīng)元，同時也證明了Nafamostat在中樞神經(jīng)疾病修復中可以起到一定的作用[22]。脊髓作為中樞神經(jīng)中腦的延伸部分，擁有中樞神經(jīng)的特性。脊髓損傷同樣也是中樞神經(jīng)的損傷，脊髓的修復也就等同于軸突的再生及突觸的重塑，我們可根據(jù)Nafamostat在腦損傷中的應用，并根據(jù)其藥理機制和適應證，探尋脊髓損傷后的病理因素和微環(huán)境是否可以被Nafamostat抑制或者改善，從而使得脊髓損傷的患者得到功能康復。最近的實驗表明，Nafamostat能夠顯著促進脊髓損傷后大鼠的運動功能恢復，顯著增加灰質(zhì)與白質(zhì)組織，還能夠降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與IL-6的表達，抑制脊髓損傷處凝血酶的表達，提高神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT-3、BDNF、NGF)的表達，起到調(diào)節(jié)脊髓損傷處微環(huán)境、改善功能與組織恢復的效果[23]。