馬 芹， 閆文卓， 周 潔， 高 誠， 劉鐵龍， 趙麗麗， 陳洪巖， 陸濤峰

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所， 哈爾濱 100193;2. 上海實驗動物研究中心， 上海 201203;3. 河南省濟源市動物衛(wèi)生監(jiān)督所， 濟源 454650)

貓泛白細胞減少癥病毒(feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV)，又稱貓瘟熱病毒，屬于細小病毒科，細小病毒屬，該病毒為單鏈DNA病毒，基因組全長約5 200 nt，編碼VP1、VP2 兩種結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP2蛋白為主要衣殼蛋白， 是FPV的主要免疫保護性抗原蛋白[1，2]。FPV感染范圍較廣，可感染貓科、鼬科及浣熊科動物，如貓、獅、虎、豹等[3]; 該病毒傳播較快，可通過感染動物的糞便、尿液及嘔吐物進行水平傳播， 妊娠母貓可垂直傳播給胎兒。FPV致病性較強， 可導致妊娠母貓流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎，死亡率高且無任何病前征兆[4]。目前該病的檢測主要依賴于病毒分離及血清學診斷，這些方法耗時長，成本高，不適用于臨床樣品的快速檢測。隨著動物園貓科動物、寵物貓的養(yǎng)殖量增多，同時，許多醫(yī)藥研究也需要實驗用貓，對貓的疫病監(jiān)測及防控需高度重視，建立一種適于臨床檢測FPV的快速檢測方法迫在眉睫。

環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification， LAMP)技術(shù)是一種新型的核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)依賴具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，利用4條特異性引物在等溫條件下擴增出LAMP特有的梯狀條帶[5，6]。LAMP技術(shù)特異性好、檢測快速、操作簡單，已在禽流感病毒[7]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒[8]、豬細小病毒[9]及豬流行性腹瀉病毒[10]等方面成功建立了快速檢測方法。本研究旨在利用LAMP技術(shù)建立一種檢測FPV的高效、快速、特異性的檢測方法，用于FPV的早期診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與樣品 FPV，貓皰疹病毒(FHV)，犬細小病毒(canine parvovirus， CPV)及犬腺病毒(canine adenovirus， CAV)由本實驗室保存; 疑似FPV感染貓臨床樣品來自上海貓養(yǎng)殖基地。

1.1.2 主要儀器和試劑 EasyPure Viral DNA/RNA Kit、2×EasyTap SuperMix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司， AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 購自美國Axygen公司， pMD18-T載體購自寶生物(大連)工程有限公司，朗報?脫氧核糖核酸擴增試劑盒和熒光目視檢測試劑盒購自榮研生物科技有限公司，K-8D型電熱恒溫水槽購自上海精宏實驗有限公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，其他常規(guī)試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上FPV的VP2基因保守序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計一對引物，序列為FPV- F： 5'-TGTAACACCTTGGTCATT-3';FPV- R： 5'- ATTCATCACCTGTTCTTA-3'，目的片段為467 bp，用于PCR擴增。同時，利用 PrimerExplore V4 軟件(http：//primerexplorer.jp/e/)針對PCR擴增序列設(shè)計LAMP擴增引物，序列為F3： 5'-TGCATCATTGATGGTTGC-3'; B3： 5'-AGTAAGTGTACTGGCACAG-3'; FIP： 5'-GGTTGGTTTCCATGGATAAAAACCTATGCCATTTACTCCAGCAG-3'; BIP： 5'-CATCTCATACTGGAACTAGTGGCATGAACATC ATCTGGATCTGTAC-3'，引物均由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA的提取 FPV， FHV， CPV， CAV按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒說明書提取DNA。

1.2.3 PCR擴增及陽性質(zhì)粒構(gòu)建 構(gòu)建PCR擴增體系 50 μL： SuperMix 25 μL，模板 2 μL， 引物 FPV- F和引物 FPV- R(10 μmol/L)各 1 μL，重蒸 H2O 補足50 μL。94 ℃ 預變性 5 min; 94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，35 個循環(huán); 72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段經(jīng)測序分析以驗證擴增片段是否正確。切膠回收PCR產(chǎn)物，連接pMD18-T載體，構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒。

1.2.4 LAMP檢測方法的建立與優(yōu)化 以提取的FPV DNA為模板，利用引物F3、B3、FIP及BIP按照LAMP試劑盒和熒光目視檢測試劑盒說明書構(gòu)建LAMP反應(yīng)體系，設(shè)置陰陽性對照，在恒溫水浴條件下進行反應(yīng)。優(yōu)化LAMP反應(yīng)溫度，分別為60℃，63℃，64℃，65℃; 同時優(yōu)化LAMP反應(yīng)時間，設(shè)置為30 min，45 min，60 min，反應(yīng)結(jié)束后，可直接目測結(jié)果，陰性樣品為橘黃色，陽性樣品為熒光綠色，或擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳在凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。

1.2.5 LAMP的敏感性檢測 利用紫外分光光度計測定構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒濃度，換算成病毒拷貝數(shù)。將質(zhì)粒10倍系列稀釋進行PCR和LAMP敏感性檢測，比較兩種方法的敏感性。

1.2.6 LAMP的特異性檢測 以構(gòu)建的最佳LAMP反應(yīng)條件對FPV、FHV、CPV及CAV進行擴增，產(chǎn)物直接目測或經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果分析，驗證該方法的特異性。

1.2.7 臨床樣品檢測 將來自上海的10份疑似FPV感染貓全血樣品，5 000×g離心3 min，取血清，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒基因組，利用本實驗建立的LAMP方法和PCR方法進行檢測和結(jié)果比較分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增

通過對PCR擴增退火溫度的優(yōu)化， 顯示在46 ℃，48℃，50℃，52℃，54℃，56℃下均可擴增出單一條帶(圖1)，初步確定最佳退火溫度為56℃并進行下一步試驗。擴增片段經(jīng)克隆測序分析，結(jié)果表明擴增得到的片段為FPV VP2基因。

2.2 LAMP擴增條件的優(yōu)化

圖1 PCR擴增退火溫度優(yōu)化Figure 1 Annealing temperature optimization of FPV PCR

通過設(shè)置不同反應(yīng)溫度，優(yōu)化LAMP擴增條件，結(jié)果表明，在60℃、63℃、64℃和65℃恒定水溫下均能擴增出典型的“梯形”條帶，陽性對照也呈“梯形”條帶，陰性對照未擴增出條帶，說明LAMP反應(yīng)體系成立。其中，當反應(yīng)溫度為65 ℃，條帶最清晰(圖2)，因此確定最佳的LAMP反應(yīng)溫度為65℃。

通過設(shè)置不同的反應(yīng)時間，優(yōu)化LAMP擴增條件，結(jié)果表明，反應(yīng)時間在30 min，45 min和60 min條件下也均可擴增出典型“梯形”條帶。其中， 當反應(yīng)時間為60 min時，條帶最清晰(圖2)，因此確定最佳的LAMP反應(yīng)反應(yīng)時間為60 min。

圖2 LAMP擴增條件的優(yōu)化Figure 2 Optimization of the FPV LAMP

2.3 LAMP的敏感性檢測

結(jié)果表明，原始陽性質(zhì)粒的拷貝數(shù)為5.01×1010拷貝/μL。分別以10倍系列稀釋的陽性質(zhì)粒作為LAMP和PCR擴增模板， 擴增結(jié)果顯示， LAMP檢測的最低拷貝數(shù)為5.01×102拷貝/μL(圖3A)，而PCR最低檢測拷貝數(shù)為5.01×103拷貝/μL(圖3B)，表明LAMP檢測方法的敏感性比PCR方法高10倍。

實驗過程中使用熒光目視檢測試劑盒，因熒光染料含有鈣黃綠素，在LAMP反應(yīng)初期因與錳離子結(jié)合而處于熒光猝滅狀態(tài)，隨著LAMP反應(yīng)的進行，鈣黃綠素逐漸恢復游離發(fā)出熒光，可實時地進行肉眼觀察或?qū)U增產(chǎn)物置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，均可明顯區(qū)分陽性和陰性，目測時陽性呈綠色，陰性為橘黃色; 在凝膠成像系統(tǒng)下，陽性有明亮的熒光，陰性為透明色或較淺的顏色(圖3C)。

2.4 LAMP的特異性檢測

圖3 PCR和LAMP敏感性分析Figure 3 Sensitive analyze of PCR and LAMP assays

選擇臨床上貓易感的4種病毒FPV、FHV、CAV及CPV進行特異性檢測。以提取FPV、FHV、CAV、CPV的DNA為模板，分別配制LAMP反應(yīng)體系，在65℃反應(yīng)60 min，對LAMP反應(yīng)的結(jié)果進行檢測，結(jié)果表明，只有FPV的LAMP擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)特異的階梯狀條帶，其它模板未擴增出條帶(圖4A)，加入熒光染料后，可觀察到FPV的LAMP擴增產(chǎn)物顯現(xiàn)明亮的熒光，而其它樣品為透明色或較淺的顏色，為陰性(圖4B)。

2.5 臨床樣品檢測

采集10份疑似FPV感染貓血清臨床樣品，提取DNA樣品，利用本實驗建立的LAMP和PCR檢測方法同時對10份樣品進行檢測，結(jié)果顯示LAMP檢出3份陽性，PCR檢出3份陽性(圖5)，兩種方法陽性符合率100%。

圖4 LAMP特異性分析Figure 4 Special analyze of LAMP assays

圖5 PCR和LAMP臨床樣品檢測Figure 5 Evaluation of PCR and LAMP assays with clinical samples

3 討論

貓泛白細胞減少癥是由FPV引起的一種急性、高度接觸性、致死性傳染病，主要發(fā)生在幼齡貓科動物，以高熱、嘔吐為主要特征[11]。近年來，貓作為寵物，飼養(yǎng)量快速增加，而寵物攜帶的疫病傳播迅速，引起了較多的負面影響。隨著寵物貓在公共場合出現(xiàn)更為頻繁，增加了寵物疫病如貓瘟熱潛在傳播流行的風險。LAMP檢測方法具有相對簡便、快捷、特異、靈敏度高及肉眼觀察等優(yōu)點， 在臨床獸醫(yī)方面有巨大的潛力。從Notomi等[5]研發(fā)LAMP技術(shù)，到Nagamine等[12]在LAMP方法中補充2條環(huán)狀引物，提高了反應(yīng)速度，縮短了反應(yīng)時間，在60～65 ℃等溫條件下水浴加熱60 min可完成目的基因的擴增，使得LAMP技術(shù)已被應(yīng)用于各種病原體的早期檢測。LAMP的反應(yīng)過程為先由外側(cè)引物擴增出一段模板，再由內(nèi)側(cè)引物與模板互補擴增靶基因片段，由于靶基因序列與內(nèi)側(cè)引物存在反向互補序列，通過雜交形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，進過反復循環(huán)擴增得到擴增產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)不等大小的梯形擴增產(chǎn)物[13]。

本研究通過對LAMP反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)條件，在65℃恒定水浴條件下反應(yīng)60 min后，80℃ 10 min將酶失活，終止反應(yīng)，可直接目測顏色反應(yīng)，也可經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，表明擴增條帶較為明亮和清晰，并且建立的LAMP檢測方法，可成功檢測到FPV，而FHV、CPV和CAV為陰性，該方法特異性較好。LAMP檢測的靈敏度達到5.01×102拷貝/μL， 比常規(guī)PCR的敏感性高10倍。與PCR擴增相比，LAMP方法具有以下優(yōu)點： (1)不需要設(shè)置一系列溫度，只需要設(shè)置一個反應(yīng)溫度和一個終止溫度; (2)實驗設(shè)備要求較低，恒溫水浴鍋即可滿足; (3)普通PCR方法檢測至少需要2～3 h，LAMP檢測只需要1 h可得到檢測結(jié)果，能在更短的時間內(nèi)完成對FPV的檢測; (4)借助熒光染料，可目測擴增結(jié)果。但需要注意的是，LAMP反應(yīng)是非常靈敏的反應(yīng)，即使混入極其微量的擴增產(chǎn)物DNA也有可能導致錯誤的測定結(jié)果， 為避免這樣的污染， 試劑配制和加樣需在超凈工作臺內(nèi)進行， 必要時， 試劑配制和反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物的電泳分析在兩個單獨的房間進行操作。

目前， 已有多種針對貓細小病毒的疫苗可以用于該病的防控， 但針對該病的抗原抗體檢測， 一直沒有商品化試劑盒， 嚴重制約實驗貓的質(zhì)量提高。由于對該病已普遍采取疫苗免疫，且沒有開發(fā)出能區(qū)分疫苗株和野毒株抗體的血清學方法，因此血清學診斷的意義有限。雖然已有多篇關(guān)于FPV病毒核酸的PCR檢測方法報道[14-16]，但LAMP方法還未見報道。該方法與PCR方法均以可能含有病毒核酸的病料樣品為檢測對象， 如糞便、血清、腸黏膜、心臟、肺臟等組織， 具有廣泛的適用性， 且該方法更加靈敏、簡便。因此， 本研究建立的LAMP方法可為FPV的核酸診斷提供一種靈敏、簡便、快速的檢測方法， 非常適用于FPV的現(xiàn)場快速檢測。