陳林中日 ， 殷冬來 ， 趙澤婷 ， 韋芊含 ， 陳 昕 ， 張雨梅 ，2

(1. 揚州大學比較醫(yī)學研究院， 揚州 225009;2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心， 揚州 225009)

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管生成、血管新生中的關鍵調(diào)節(jié)因子[1]。VEGF與其受體(VEGFR)特異性結合， 能調(diào)節(jié)血管發(fā)生、形成， 參與造血以及淋巴管生成，也能通過改變腫瘤內(nèi)環(huán)境而增加毛細血管通透性[2]。新血管的形成是腫瘤生長和轉移過程中的一種基本活動。腫瘤的生長、轉移依賴于腫瘤血管的新生， 且腫瘤細胞分泌VEGF。由于VEGF及VEGFR途徑在腫瘤血管生成中的中心作用，已成為腫瘤學領域藥物研發(fā)和基礎研究的焦點[3]。近幾年，VEGF家族成員及其相關的通路被認為是實體腫瘤重要的抗血管治療靶點[4]。

RNA干擾(RNAi )是一種能特異性使得序列在轉錄后沉默的技術，具有高度特異性、高效性、高穩(wěn)定性的特點。其方法是將外源雙鏈小分子RNA轉染進細胞，通過與目的基因mRNA特異性結合并使其降解，從而使目的基因表達降低，該技術廣泛用于基因功能的研究[5]。本文根據(jù)大鼠Vegfa、Vegfr的基因序列，設計合成相應的小干擾RNA(siRNA)， 轉染大鼠血管內(nèi)皮細胞， 通過RT-PCR和Western blot檢測內(nèi)皮細胞中VEGF及VEGFR的表達，篩選出有效沉默Vegf/Vegfr基因的siRNA序列，為進一步應用靶向Vegf/Vegfr基因RNA干擾抗血管生成的研究奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級6周齡雄性Wistar大鼠， 體質(zhì)量180 g左右。揚州大學比較醫(yī)學中心提供[SCXK(蘇)2017-0004]，飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中[SYXK(蘇)2017-0044]。實驗動物的使用及研究方案獲揚州大學動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

DMEM、Opti-MEM培養(yǎng)基， 美國Gibco公司;胎牛血清(FBS)， 美國Hyclone公司; 重組大鼠VEGF165， 美國 Peprotech 公司; EntransterTM-R4000轉染試劑，北京英格恩生物公司; 兔抗大鼠VEGF多克隆抗體、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、HRP標記IgG， 武漢博士德生物有限公司; 青鏈霉素、明膠、胰蛋白酶、兔抗大鼠FLK1多克隆抗體、兔抗大鼠FLT1多克隆抗體， 上海生工生物工程有限公司; BCA蛋白溶度測定試劑盒、PMSF、RIPA強蛋白裂解液、BSA粉、Tris-base、SDS、Tween-20、30%丙烯酰胺、TEMED、過硫酸胺等， 碧云天生物有限公司; PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、DL1000 DNA Marker、RNA提取試劑盒，TaKaRa (大連寶生物)公司。

1.3 主要儀器與設備

Leica DM3000倒置顯微鏡，德國Leica公司;Synergy小型純水系統(tǒng)、0.22 mm Millex-GP過濾器，美國默克密理博公司; 多功能酶標儀，美國BioTek公司; PCR儀、Proteah電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司; THZ-82A搖床，金壇市白塔金昌實驗儀器廠; 細胞培養(yǎng)板，丹麥Corstar Corning公司。

1.4 方法

1.4.1 靶向Vegf/Vegfr基因siRNA序列的設計與合成 根據(jù)NCBI中大鼠Vegf-a ID-83785、Flt1(Vegfr1) ID-54251、Flk1 (Vegfr2) ID-25589基因序列，由上海吉瑪生物有限公司分別設計合成三條候選siRNA序列，以及一條與目的基因序列無同源性的陰性對照序列(NC)，和帶有5-羧基熒光法(FAM)熒光標記的陰性siRNA序列(表1)。

1.4.2 大鼠內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞分離、純化及鑒定方法參照文獻[8]。Wistar大鼠的胸主動脈分離、清洗后， 用手術刀切成1 mm×1 mm的血管塊， 移至鋪好明膠的細胞培養(yǎng)瓶中， 使得血管內(nèi)膜貼壁，加入1 mL的完全培養(yǎng)基后， 置于37 ℃，體積分數(shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后于倒置顯微鏡下觀察，待有星形的內(nèi)皮細胞遷出并生長良好時，棄去植塊。當細胞長至80%時，棄去原培養(yǎng)基并用PBS洗2遍后，加0.25%胰蛋白酶1 mL，用差速消化法[8]去除雜細胞，終止消化，制成單細胞懸液后分瓶培養(yǎng)。經(jīng)CD31免疫組化鑒定為血管內(nèi)皮細胞后收集第3代血管內(nèi)皮細胞用于以下的轉染實驗。

1.4.3 siRNA轉染條件的篩選 將細胞密度調(diào)整為5×104個/mL的內(nèi)皮細胞接種于24孔板中，每孔400 μL。次日分別取50 nmol/L， 80 nmol/L， 100 nmol/L的FAM標記的陰性siRNA加入50 μL的opti-MEM無血清培養(yǎng)基混勻， 制成RNA稀釋液; 分別取0.4 μL，0.5 μL， 1.0 μL的EntransterTM-R4000轉染試劑，加入50 μL的opti-MEM無血清培養(yǎng)基充分混勻制成EntransterTM-R4000稀釋液。將EntransterTM-R4000稀釋液和RNA稀釋液進行單因素交叉試驗篩選轉染復合物的條件。將100 μL的轉染復合物滴加到400 μL的完全培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染后6 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗3遍后，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光情況，確定轉染效率。同時以未轉染組(只加siRNA)作為陰性對照組。根據(jù)綠色熒光數(shù)確定轉染效率較好的轉染條件。

表1 靶向大鼠Vegf/Vegfr 基因siRNA序列及陰性對照序列Table 1 The siRNA sequences target on rat Vegf/Vegfr genes and negative control

1.4.4 靶向大鼠Vegf/Vegfr siRNA的轉染 根據(jù)

1.4.3 中確定的轉染條件， 以及24孔板與6孔板表面積的換算， 確定在6孔板中向內(nèi)皮細胞轉染Vegf/Vegfr siRNA的條件為： 6孔板中細胞數(shù)為1.4×104個/孔，使用100 nmol/L的siRNA與2.5 μL的轉染試劑混合進行轉染。試驗分組如下： 正常組、只加轉染試劑組(mock 組)、Vegf siRNA 組(si1157、si1263，、si1323)、Flt1 siRNA 組(si326、si2703、si3365)和Flk1 siRNA組(si1046、si1292、si1406)。于轉染后24h檢測細胞中Vegf/Vegfr的mRNA水平; 轉染后48 h進行細胞中VEGF/VEGFR蛋白表達的檢測。

1.4.5 靶基因沉默效應檢測

1.4.5.1 Western blot檢測VEGF/VEGFR的表達 轉染細胞后48 h，加入含有PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細胞2 min后，細胞刮刮取細胞裂解產(chǎn)物，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，小心吸取上清即為蛋白樣品。按BCA蛋白濃度試劑盒的說明書，測定樣品中的蛋白濃度并調(diào)整至相同。加入6×上樣緩沖液(loading buffer)，沸水浴煮沸10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，VEGF的分離采用5%濃縮膠和10%分離膠；FLT1和FLK1的分離采用5%的濃縮膠和8%的分離膠。待測樣品加樣15 μL，80 V恒壓電泳約30 min，當溴酚藍前緣進入分離膠后電壓提到110 V至結束。300 mA恒流120 min進行轉膜。轉膜后，5%BSA室溫封閉2 h，分別加入TBST稀釋的VEGF，F(xiàn)LK1，F(xiàn)LT1及β-actin一抗(β-actin，VEGF抗體1∶300稀釋;FLT1和FLK1抗體1∶800稀釋)，4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌，100 r/min， 5 min×5次。加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。TBST洗滌，100 r/min，5 min×5次。然后加入ECL發(fā)光液，置凝膠成像系統(tǒng)拍照。使用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析。

1.4.5.2 RT-PCR檢測Vegf/Vegfr的mRNA水平 根據(jù)NCBI中大鼠Vegf、Flk1、Flt1、β-actin基因序列，使用premier5.0軟件設計PCR引物，引物序列由上海生工生物有限公司合成。引物序列及產(chǎn)物片段大小如表2。

內(nèi)皮細胞轉染后24 h，棄去細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次后加入350 μL的裂解Buffer RL(加入50 ×DTT Solution)，按RNA提取試劑盒說明書操作，將裂解液轉移到gDNA Eraser Spin Column中，12 000 r/min離心1 min; 向2 mL Tube中加入等體積的70%乙醇使溶液混合均勻。將混合液轉到RNA Spin Column 中， 12 000 r/min 離心 1 min， 棄濾液。將RNA Spin Column放回到2 mL Collection Tube中。將400 μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中， 12000 r/min 離心 30 s， 棄濾液。將 400 μL 的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中， 12000 r/min離心30 s， 棄濾液。在RNA Spin Column膜中央處加入50 μL的不含RNase的蒸餾水室溫靜置5 min，12 000 r/min離心2 min，收集RNA。取1.0 μL RNA溶液，于260 nm和280 nm處測定吸光度(A)值，并計算A260/A280，檢測RNA的純度。并調(diào)節(jié)各樣品中RNA濃度保持一致。

表2 RT-PCR擴增Vegf/Vegfr的引物Table 2 Primers of RT-PCR for Vegf/Vegfr genes

利用TaKaRa反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA， 預變性反應體系為及dNTP Mixture(10 mmol/L)1.0 μL，Oligo Primer(5 μmol/L) 1.0 μL，模板 RNA 600 ng，不含RNase蒸餾水加至10 μL。 cDNA合成條件為上述變性后反應液10 μL， 5×Prume ScriptⅡBuffer 4.0 μL， Prime ScriptⅡRTase 0.5 μL (20U)，RNase Inhibitor (40μ/ μL) 1.0 μL，不含 RNase蒸餾水加至 20 μL。

RT- PCR反應體系為25 mL，正反向引物各0.5 μL， dNTP 2.0 μL， 酶 0.15 μL， 10 × buffer 2.5 μL，DNA 模板 1.0 μL， 蒸餾水 18.35 μL。RT-PCR 反應條件為95 ℃，5 min; (95 ℃，30 s; 56 ℃，40 s;72 ℃，45s)× 35; 72 ℃，5 min。RT-PCR 反應產(chǎn)物4℃保存。

1.5 統(tǒng)計分析

采用 Graph Pad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，結果均以x- ± s表示。One-way ANOVA 用于顯著性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 靶向vegf/vegfr基因siRNA對大鼠內(nèi)皮細胞轉染條件的篩選

FAM標記的陰性siRNA在轉染6 h后的部分圖片見圖1。正常未轉染組在熒光顯微鏡下無熒光，而100 nmol/L siRNA與0.5 μL或1.0 μL轉染試劑時， 相比較于其他組合其熒光亮度及具有熒光細胞數(shù)較多， 轉染效率較好(圖1D，E)。選擇100 nmol/L siRNA與0.5 μL轉染試劑的組合為正式試驗的轉染條件，用于以下目的基因的轉染試驗。

2.2 蛋白水平篩選siRNA有效沉默序列

從圖2可見，轉染Vegf siRNA的三條siRNA序列(si1157， si1263， si1323)都對內(nèi)皮細胞中 VEGF蛋白的表達起到了極顯著的沉默效果(P＜0.001)。對VEGF蛋白表達的抑制率，si1157約48%，si1263約60%，si1323達69%，si1323序列對VEGF蛋白表達的沉默效果最好。轉染試劑組與對照組相比無統(tǒng)計學差異。

轉染Flt1 siRNA的三條序列中，si326與si3365序列對FLT1蛋白的表達起到了明顯的抑制作用，而si2703序列對FLT1蛋白的表達無明顯影響。si326序列對FLT1表達的沉默效率約27%， si3365序列達70%，si3365序列對FLT1蛋白表達的沉默效率最好。轉染試劑組與對照組相比無統(tǒng)計學差異。

轉染Flk1 siRNA的三條序列中，si1292序列和si1406序列對FLK1蛋白的表達起到了顯著的抑制作用(P＜0.01)，沉默效率si1292約62%，si1406序列約33%，si1292序列對FLK1蛋白表達的沉默效率最好。si1046序列對FLK1的表達無明顯影響，轉染試劑組與對照組相比無統(tǒng)計學差異。

2.3 mRNA水平篩選siRNA有效沉默序列

從圖3可見，轉染Vegf siRNA的三條siRNA序列(si1157，si1263，si1323)中，si1263和si1323都對內(nèi)皮細胞中Vegf mRNA表達起到了極顯著的沉默效果(P＜0.001)。對Vegf基因表達的沉黙效率，si1263約47%，si1323序列達51%，si1323序列對Vegf mRNA表達的沉默效果最好，與正常組相比差異極顯著(P＜0.001)。

轉染Flt1 siRNA的三條序列(si326，si2703，si3365)中，si2703序列與si3365對Flt1基因的表達起到了沉默效果。對Flt1 mRNA表達的沉默效率，si2703約16%，si3365序列達71%。si3365序列對Flt1基因表達的沉默效率最好，與正常組相比差異極顯著(P＜0.001)。

轉染Flk1 siRNA的三條序列(si1046，si1292，si1406)中，只有si1292序列對Flk1基因的表達起到了極顯著的沉默效果(P＜0.001)。

3 討論

靶向大鼠Vegf/Vegfr基因的siRNA序列，轉染內(nèi)皮細胞的最佳轉染條件為100 nmol/L siRNA與0.5 μL的轉染試劑組合。篩選出可以有效沉默Vegf基因的兩條siRNA序列si1263和si1323，其中si1323序列的沉默效果更好; 靶向Flt1 基因的si3365可以有效沉默F(xiàn)lt1，而靶向Flk1 基因的si1292可以有效沉默F(xiàn)lk1基因。篩選出的靶向大鼠Vegf及Vegfr基因的siRNA有效序列，可作為血管生成及血管生成相關因子研究中的一種有效工具，為應用RNAi技術進行Vegf/Vegfr基因沉默研究奠定實驗基礎。

圖1 不同劑量siRNA與轉染試劑的轉染效率Figure 1 Transfection effect of different dose siRNA and transfection reagent

圖2 Western blot檢測轉染后VEGF/VEGFR的表達Figure 2 Western blot analysis for VEGF/VEGFR in endothelial cells transfected

圖3 RT-PCR檢測Vegf/Vegfr mRNA水平Figure 3 The mRNA levels of Vegf/Vegfr genes detected by RT-PCR

RNA干擾是一種在進化過程中存在的高度保守、由雙鏈RNA分子誘發(fā)同源mRNA高效特異性降解的基因轉錄的沉默現(xiàn)象[7]。其中21-23nt的siRNA是RNAi中的關鍵因子[8]。由于RNAi具有高度特異性、可遺傳性、高穩(wěn)定性等優(yōu)點而被廣泛用于細胞內(nèi)信號轉導途徑的分子機制研究。

RNAi提供了一種高效、方便、經(jīng)濟的干擾特異性基因表達的研究手段，并逐步發(fā)展成為腫瘤基因治療、遺傳性疾病治療的重要方法。但隨著研究的深入，許多研究表明并不是所有針對靶基因mRNA序列隨機設計的siRNA都能起到有效的基因沉默，因此干擾靶序列的選擇至關重要。本實驗由上海吉瑪針對大鼠Vegf/Vegfr基因設計3條siRNA序列，以確保至少有一條siRNA能夠高效抑制靶基因的表達。同時設計一條陰性對照siRNA序列，并使用FAM熒光標記的陰性siRNA作為“陽性對照”觀察轉染效率，篩選出轉染效率最高，細胞毒性最小的EntransterTM-R4000轉染試劑的量(0.5μL)和siRNA的溶度(100 nmol/L)。使用轉染試劑將靶向Vegf/Vegfr基因的siRNA按照篩選出的最佳終溶度100 nmol/L轉染大鼠血管內(nèi)皮細胞，經(jīng)RT-PCR及Western blot方法檢測mRNA水平和蛋白水平的沉默效果。結果表明靶向Vegf基因的3條siRNA序列中si1263和si1323序列對靶Vegf基因的沉默效果最佳; 靶向Flt1基因的3條siRNA序列中si3365序列沉默效果最佳; 靶向Flk1基因的3條siRNA序列中si1292序列干擾效果最好。