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復(fù)合小漿果果酒中的酚類物質(zhì)及其抗氧化活性分析

2019-03-01 12:31:58王婷婷苑偉李華王華
食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年3期
關(guān)鍵詞:酒樣漿果單寧

王婷婷,苑偉,李華,3*,王華,3*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌,712100) 2(山東黑尚莓生物技術(shù)發(fā)展股份有限公司,山東 煙臺(tái),264000)3(陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,陜西 楊凌,712100)

小漿果是一類營(yíng)養(yǎng)活性成分含量豐富的健康水果,是居民日常攝入的營(yíng)養(yǎng)膳食,可對(duì)人體健康產(chǎn)生一定益處[1]。常見(jiàn)的小漿果包括在地中海國(guó)家大面種植的樹莓、黑莓等,還有如桑葚等原產(chǎn)于中國(guó)的小漿果,這些漿果含水率高,鮮果易變質(zhì),適合釀造商業(yè)果酒[2-3]。在適量飲用的前提下,小漿果果酒中的營(yíng)養(yǎng)活性成分可在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗氧化等功效,小漿果果酒中發(fā)揮抗氧化作用最主要的植物化學(xué)成分就是包括花色苷和鞣花單寧在內(nèi)的各種酚類物質(zhì)[4-5],其中鞣花單寧是一種廣泛存在于漿果中的天然酚類物質(zhì),最常見(jiàn)的鞣花單寧組分包括鞣花酸和聚合的sanguiin H-6和lambertianin-C,通過(guò)酸水解,聚合的鞣花單寧發(fā)生酯鍵斷裂基團(tuán)重排,轉(zhuǎn)化成鞣花酸[5]。

目前大多數(shù)關(guān)于果酒的研究都是對(duì)單品種果酒成分的分析[6-8],對(duì)幾種水果釀造的復(fù)合果酒酚類物質(zhì)與抗氧化活性的研究未見(jiàn)報(bào)道。與單品種果酒相比,復(fù)合小漿果果酒不僅可以通過(guò)調(diào)整原料比例減少外源糖酸的添加,豐富口感和香氣復(fù)雜性,同時(shí)還可以提升果酒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,最大程度滿足人們對(duì)果酒感官和營(yíng)養(yǎng)的需求。

基于上述原因,本試驗(yàn)測(cè)定不同原料配比的復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)含量及其自由基清除率,分析這些營(yíng)養(yǎng)活性成分在果酒的保留率及自由基清除率的相關(guān)性,為復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)抗氧化相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為4款不同原料和配比的復(fù)合小漿果果酒,果酒原料為2016年不同月份采收的2種紅色和3種黑色小漿果,其中紅樹莓和黑加侖產(chǎn)自黑龍江省尚志市,紅枸杞產(chǎn)自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市,黑桑葚產(chǎn)自四川涼山彝族自治州,黑莓產(chǎn)自江蘇省連云港市。原料-40 ℃低溫速凍后在-20 ℃低溫冷藏,待全部采收后于9月初投料釀造。復(fù)合果酒配比按照山東黑尚莓生物技術(shù)開發(fā)股份有限公司復(fù)合果酒專利[9]按一定質(zhì)量百分?jǐn)?shù)投料,4款復(fù)合小漿果果酒配比如表1所示。

表1 復(fù)合小漿果果酒配比Table 1 The formula of compound small berry wine

釀造工藝如下:

去除雜質(zhì)、破碎凍果→回溫至5 ℃、按0.02 g/kg的比例添加果膠酶→再回溫至10 ℃、按0.2 g/kg的比例添加酵母→15 ℃低溫發(fā)酵→分離原酒、調(diào)硫(40 mg/L)、滿罐儲(chǔ)藏→自然沉降倒罐下膠、酒泥壓濾紙板過(guò)濾→不銹鋼罐陳釀1年。

葡萄糖、CuSO4·5H2O、KIO3、抗壞血酸、2,6-二氯靛酚、Folin-Ciocalteu試劑、Na2CO3、NaNO2、AlCl3、NaOH、KCl、C2H3NaO2·3H2O、FeSO4·7H2O、水楊酸和蘆丁(rutin,RE):分析純,購(gòu)于廣州金華化學(xué)試劑有限公司;沒(méi)食子酸(gallic acid,GAE)、原兒茶酸、綠原酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、對(duì)香豆酸、反式阿魏酸、槲皮素、山奈酚和鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品:色譜純,購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司;2,2′-聯(lián)氨-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):分析純,購(gòu)于上海阿拉丁生物化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C雷磁pH計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;磁力加熱攪拌器,常州國(guó)華電器有限公司;FD-1C-50冷凍干燥器,北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;Cary60 UV-Vis紫外分光光度計(jì),安捷倫科技有限公司;LC-20A高效液相色譜儀(SPD-M20A檢測(cè)器,SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器及CLASS-VP工作站),日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料酚類物質(zhì)提取

準(zhǔn)確稱取定量各凍果樣品冷凍干燥機(jī)中凍干,樣品干燥后粉碎。取1 g干粉于50 mL離心管,加入20 mL鹽酸甲醇溶液[V(鹽酸)∶V(甲醇)∶V(水)=1∶600∶400],超聲提取30 min后離心10 min,移取上清液,重復(fù)3次,合并上清液定容。

1.3.2 基本理化指標(biāo)的測(cè)定

依據(jù)葡萄酒分析檢驗(yàn)[10],測(cè)定復(fù)合果酒的基本理化指標(biāo):酒精度采用密度瓶法;還原糖采用斐林試劑法,含量以葡萄糖計(jì);滴定酸采用NaOH滴定法,含量以檸檬酸計(jì);揮發(fā)酸采用NaOH滴定法,含量以醋酸計(jì);總硫采用氧化法;維生素C采用2,6-二氯靛酚滴定法。

1.3.3 總酚、總類黃酮、總花色苷和鞣花單寧的測(cè)定

總酚采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定[11],含量以沒(méi)食子酸表示??傤慄S酮采用NaNO2-AlCl3分光光度法測(cè)定[12],含量以蘆丁表示??偦ㄉ詹捎胮H示差法測(cè)定[13],含量以矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside,C3G)表示。鞣花單寧采用HPLC測(cè)定[14],樣品前處理方法為將待測(cè)樣與鹽酸甲醇[V(甲醇)∶V(鹽酸)=9∶1]等體積混合,85 ℃水解8 h。

1.3.4 單體酚的測(cè)定

單體酚采用HPLC測(cè)定[15]。酒樣前處理為酒樣、乙酸乙酯與乙腈以體積比為5∶5∶1混合,離心后移取上清液,重復(fù)3次,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并的有機(jī)系蒸干,用甲醇溶解。色譜條件:Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;流動(dòng)相:(A)為1%乙酸水溶液,(B)為50%乙腈水溶液(含1%乙酸);洗脫梯度程序:0~3 min,10%;3~15 min,10%~15%B;15~25 min,15%~50%B;25~35 min,50%~60%B;35~45 min,60%~80%B;45~50 min,80%B;50~55 min,80%~10%B;進(jìn)樣量20 μL;260 nm處檢測(cè)槲皮素和山奈酚,280 nm波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)沒(méi)食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、兒茶素和表兒茶素,320 nm處檢測(cè)綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸。

1.3.5 抗氧化活性的測(cè)定

抗氧化活性分別采用ABTS、DPPH和羥基(·OH)自由基清除率的方法進(jìn)行測(cè)定,ABTS和DPPH自由基清除率方法參照梁莎等[16],羥基(·OH)自由基清除率測(cè)定方法參照SROKA等[17]。酒樣測(cè)定吸光值為Ai,用甲醇代替酒樣測(cè)對(duì)照值為Ac,自由基清除率的計(jì)算公式如式(1)。

(1)

公式(1)中:Ai,酒樣吸光值;Ac,對(duì)照吸光值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2007繪制圖表;SPSS 20.0的Turkey檢驗(yàn)確定組間差異顯著性,不同小寫字母表示差異顯著;采用Pearson相關(guān)性分析方法檢驗(yàn)并得出變量之間的相關(guān)系數(shù)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小漿果果實(shí)原料理化指標(biāo)

表2為5種果實(shí)原料的理化指標(biāo)。黑桑葚糖酸比最高,其次是紅枸杞,紅樹莓、黑莓和黑加侖的糖酸比均較低。黑色小漿果加入果膠酶后的出汁率均在78%以上,紅色小漿果的出汁率在50%~60%之間。紅枸杞和黑桑葚鮮果的維生素C含量均顯著高于其他3種小漿果。酚類物質(zhì)方面,黑桑葚總酚、總類黃酮和總花色苷含量均位于5種原料之首,其他2種黑色小漿果(黑加侖和黑莓)酚類物質(zhì)含量全部高于紅色小漿果。5種漿果中只有紅樹莓和黑莓含鞣花單寧,黑莓鮮果的鞣花單寧含量是紅樹莓的1.38倍。

表2 果實(shí)原料理化指標(biāo)Table 2 The physicochemical indexes of the raw material

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 復(fù)合小漿果果酒理化指標(biāo)及營(yíng)養(yǎng)活性成分保留率

表3為復(fù)合小漿果果酒的理化指標(biāo),可以看出紅樹莓、黑桑葚、黑莓、黑加侖和紅枸杞5種原料釀造的復(fù)合小漿果果酒(A和B)與黑桑葚、黑莓和黑加侖釀造的復(fù)合小漿果果酒(C和D)相比,酒精度略低而殘?zhí)禽^高(均高于4.0 g/L)。C和D的滴定酸含量顯著低于A和B,這些說(shuō)明可以通過(guò)調(diào)整復(fù)合果酒原料減少外源糖酸的添加。4款酒樣揮發(fā)酸和總硫分別低于GB 15037—2006中規(guī)定的1.2 g/L和GB 2758—2005的250 mg/L。C和D的維生素C的含量均高于A和B,相同原料不同配比的酒樣維生素C含量差異不顯著。C和D的總酚和總類黃酮含量顯著高于A和B,同時(shí)D酒樣的總酚含量顯著高于其他小漿果復(fù)合果酒,而D的總類黃酮含量與C沒(méi)有顯著差異。黑色小漿果占比高的總花色苷含量較多,D酒樣總花色苷含量遠(yuǎn)高于其他。由于僅紅樹莓與黑莓中含有鞣花單寧,因此它們占比較高的復(fù)合果酒A和B鞣花單寧含量更高。

表3 復(fù)合小漿果果酒理化指標(biāo)Table 3 The physicochemical indexes of compound small berry wine

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

經(jīng)過(guò)計(jì)算復(fù)合果酒與加權(quán)后的果實(shí)原料營(yíng)養(yǎng)活性成分含量的比值得出復(fù)合果酒中營(yíng)養(yǎng)活性成分保留率,由表4可知維生素C的平均保留率僅為13.52%,果實(shí)冷藏與果汁壓榨釀造及陳釀過(guò)程可能對(duì)維生素C產(chǎn)生了較大的負(fù)面影響[18-21]。

表4 營(yíng)養(yǎng)活性成分保留率 單位:%

同時(shí)果實(shí)冷藏與果酒釀造及陳釀對(duì)不同酚類物質(zhì)產(chǎn)生了不同程度影響[22-23],復(fù)合果酒總酚、總類黃酮、總花色苷和鞣花單寧的平均保留率分別為42.84%、52.32%、44.02%和50.54%,4種復(fù)合果酒的平均保留率大小為:D>C>B>A。

2.3 復(fù)合小漿果果酒單體酚含量

圖1是復(fù)合小漿果果酒單體酚的HPLC色譜圖,可以看出A和B沒(méi)食子酸、咖啡酸和對(duì)香豆酸含量顯著高于C和D。C和D原兒茶酸和綠原酸含量顯著高于A和B。表5是復(fù)合小漿果果酒單體酚含量,將HPLC檢測(cè)到復(fù)合小漿果果酒的酚酸分為羥基苯甲酸和羥基肉桂酸2類,這4款酒樣的羥基苯甲酸平均含量為85.78 mg/L,羥基肉桂酸平均為16.40 mg/L,比例約為5∶1,說(shuō)明復(fù)合果酒中羥基苯甲酸,特別是沒(méi)食子酸和原兒茶酸占總酚酸含量比重較大。復(fù)合果酒的羥基苯甲酸含量大小為:B>A>C>D,羥基肉桂酸含量大小為:A>B>C>D,由此可知從整體上看A和B的總酚酸含量顯著高于C和D,C總酚酸含量顯著高于D。HPLC檢測(cè)到復(fù)合果酒單體類黃酮分為黃酮醇和黃烷-3-醇,黃酮醇含量大小為:C>A>D>B,黃烷-3-醇含量大小為:C>D>B>A,C中黃酮醇和黃烷-3-醇含量顯著高于其他3款復(fù)合果酒,與原料相同的D相比,黃酮醇和黃烷-3-醇含量仍高出27.02%和27.45%。

1-沒(méi)食子酸;2-原兒茶酸;3-綠原酸;4-兒茶素;5-對(duì)羥基苯甲酸;6-香草酸;7-咖啡酸;8-丁香酸;9-表兒茶素;10-對(duì)香豆酸;11-阿魏酸;12-槲皮素;13-山奈酚圖1 復(fù)合小漿果果酒單體酚HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of individual phenol ofcompound small berry wine

2.4 復(fù)合小漿果果酒自由基清除率

復(fù)合小漿果果酒的抗氧化活性較強(qiáng),圖2是4款復(fù)合小漿果果酒的自由基清除率的比較,可以看出復(fù)合小漿果果酒ABTS自由基清除能力最強(qiáng),清除率均在77%以上,DPPH次之,羥基(·OH)最弱。同時(shí)可以看到復(fù)合果酒ABTS自由基清除能力差異并不顯著,僅D的自由基清除率顯著高于其他酒樣。4款復(fù)合果酒的DPPH和羥基(·OH)自由基清除能力差異顯著,A和B自由基清除率顯著高于C和D酒樣。相同原料的酒樣羥基(·OH)自由基清除率沒(méi)有顯著差異,所有酒樣DPPH自由基清除率都有顯著差異,大小為:B>A>C>D,與總酚酸含量趨勢(shì)一致。

2.5 復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)含量與自由基清除率相關(guān)性

復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)與抗氧化活性關(guān)系密切,表6是復(fù)合果酒酚類物質(zhì)與自由基清除率的相關(guān)性。復(fù)合小漿果果酒中總酚與總類黃酮、總花色苷以及黃酮醇和黃烷-3-醇含量呈強(qiáng)的正相關(guān)(r>0.6),與總酚酸和鞣花單寧呈極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性(∣r∣>0.8)。ABTS自由基清除率與總酚呈極強(qiáng)正相關(guān)性(r=0.817),DPPH和羥基(·OH)自由基清除率與總酚、總類黃酮、總花色苷均為極強(qiáng)負(fù)相關(guān)性,與總酚酸和鞣花單寧則均呈極強(qiáng)正相關(guān)。C和D總酚含量較高,因此它們ABTS自由基清除率較高,A和B總酚酸和鞣花單寧含量較高,因此它們DPPH和羥基(·OH)自由基清除率較高。

續(xù)表5

出峰序號(hào)酚類化合物單體酚含量/(mg·L-1)ABCD類黃酮黃酮醇12槲皮素29.00±0.22b7.53±0.35d35.97±0.46a26.83±0.29c13山奈酚0.42±0.02c0.98±0.05a0.86±0.03b0.06±0.02d合計(jì)29.42±0.24b8.51±0.35d36.83±0.43a26.88±0.32c黃烷-3-醇4兒茶素32.50±1.21d37.25±2.21c72.12±0.65a51.33±1.28b9表兒茶素2.83±0.10b3.06±0.12a3.29±0.26a3.37±0.13a合計(jì)35.33±1.31d40.30±2.33c75.40±0.39a54.70±1.38b黃酮醇+黃烷-3-醇64.75±1.09d48.81±2.40c112.24±0.50a81.58±1.21b

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 復(fù)合小漿果果酒自由基清除率
Fig.2 Free radical scavenging rate of compound small
berry wine
注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

黑色小漿果釀造的復(fù)合果酒維生素C、總酚、總類黃酮、總花色苷以及黃酮醇和黃烷-3-醇含量高于有紅色小漿果加入的復(fù)合果酒,D的配比更佳;紅樹莓和黑莓釀造的復(fù)合果酒總酚酸和鞣花單寧含量較高,B的配比更佳。相同原料條件下B和D配比的復(fù)合果酒營(yíng)養(yǎng)活性成分保留率也更高。復(fù)合果酒中總酚含量與ABTS自由基清除率、總酚酸和鞣花單寧含量與DPPH和羥基(·OH)自由基清除率極強(qiáng)正相關(guān),因此全部以黑色小漿果釀造的復(fù)合果酒ABTS自由基清除能力較強(qiáng),以紅樹莓為主要釀造原料的復(fù)合果酒DPPH和羥基(·OH)自由基清除能力較強(qiáng)。試驗(yàn)表明復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)對(duì)抗氧化活性具有顯著影響,改變?cè)霞芭浔瓤梢燥@著影響復(fù)合果酒各酚類物質(zhì)含量及其抗氧化能力,這為復(fù)合果酒滿足感官要求的前提下根據(jù)營(yíng)養(yǎng)需求確定最佳原料和配比提供了一定的理論依據(jù)。

表6 酚類物質(zhì)與自由基清除率相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficients of phenol contents and free radical scavenging rate

注:*顯著相關(guān)(P<0.05);**極顯著相關(guān)(P<0.01)

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