朱元美， 尹步金， 張 旭， 唐保露， 程宇鵬， 楊解人， 鄭書國, 2, 3△

(皖南醫(yī)學(xué)院 1藥理學(xué)教研室, 2定量藥理研究所, 3藥物研發(fā)中心， 安徽 蕪湖 241002)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥之一，也是引起終末期腎功能衰竭的主要原因之一[1]。DN的主要病理特征是腎纖維化，表現(xiàn)為腎臟固有細(xì)胞在致纖維化因子的作用下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，同時(shí)ECM降解減少，導(dǎo)致腎組織ECM過度集聚，進(jìn)一步促進(jìn)腎小球硬化、腎臟纖維化和腎功能喪失[2]。高血糖是DN的主要誘發(fā)因素之一，長期高血糖可通過多種途徑誘發(fā)腎纖維化，其中誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells，GMCs)表型轉(zhuǎn)化并大量分泌ECM是糖尿病引起腎纖維化的主要機(jī)制之一[3]。在長期高糖刺激下，GMCs由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋撤置诒硇偷幕罨癄顟B(tài)，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)上調(diào)，ECM合成和分泌增加，導(dǎo)致ECM蓄積而形成腎纖維化[4]。同時(shí)ECM的堆積可擠壓毛細(xì)血管，腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變，組織缺血缺氧，進(jìn)一步促進(jìn)腎纖維化的發(fā)展。因此，抑制GMC表型轉(zhuǎn)化和ECM分泌，是防治糖尿病腎纖維化、改善糖尿病預(yù)后的有效途徑之一。

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是中藥丹參的主要活性成分之一，具有抗氧化和抗炎等多種藥理活性[5]。前期研究表明，丹酚酸B可明顯減輕糖尿病大鼠腎纖維化，但對其確切分子機(jī)制目前仍不明確。本研究采用體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞(human glomerular mesangial cells，HGMCs)，觀察丹酚酸B對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及膠原等ECM分泌的影響，并探討其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

1.1細(xì)胞與藥物 HGMCs(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)。丹酚酸B(>98%)，上海源葉生物科技有限公司。

1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；CCK-8試劑盒(生物科技有限公司)；Ⅰ型膠原(collagen type I，ColⅠ)、Ⅲ型膠原(collagen type III，ColⅢ)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和層粘連蛋白(laminin，LN)ELISA檢測試劑盒(浙江惠嘉生物科技股份有限公司)；RIPA裂解液和BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光試劑盒(上海天能科技有限公司)；抗β-actin、α-SMA、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、Smad2、p-Smad2、p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)和p-p38 MAPK抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3主要儀器 高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀(TECAN)；Fluor Chem FC3 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Protein Simple)；Mini PROTEAN轉(zhuǎn)膜儀和PowerPac 300型電泳儀(Bio-Rad)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HGMCs置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中，用DMEM低糖培養(yǎng)基(5.5 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至近融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。

2.2ECM分泌水平檢測 將處于對數(shù)生長期的HGMCs接種于96孔板(每孔1×104)，培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照(control)組、高糖(high glucose，HG)組及高糖+Sal B高劑量(Sal B-high dose, Sal B-H，1×10-5mol/L)、中劑量(Sal B-middle dose, Sal B-M, 1×10-6mol/L)和低劑量(Sal B-low dose, Sal B-L, 1×10-7mol/L)組。正常對照組繼續(xù)用正常糖(5.5 mmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖組和高糖+Sal B各組更換為高糖(33.3 mmol/L)培養(yǎng)基，高糖+Sal B各組同時(shí)加入相應(yīng)濃度的丹酚酸B，孵育72 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明測定ColⅠ、Col Ⅲ、FN和LN的水平。

2.3Western blot檢測 將HGMCs接種于6孔培養(yǎng)板(每孔1×106)，細(xì)胞分組及處理同2.2項(xiàng)。收集細(xì)胞后RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)冰浴裂解2 h，12 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液BCA法測蛋白濃度。加上樣緩沖液混勻，煮沸5 min。SDS-PAGE分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入抗β-actin、α-SMA、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、p38 MAPK和p-p38 MAPK抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育2 h，滴加ECL發(fā)光液顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并分析條帶光密度，結(jié)果以α-SMA/β-actin、TGF-β1/β-actin、p-Smad2/Smad2和p-p38 MAPK/p38 MAPK表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丹酚酸B對高糖誘導(dǎo)HGMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

HGMCs在高糖環(huán)境下孵育72 h后，α-SMA的表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)，說明HGMCs在高糖作用下發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化，向肌成纖維細(xì)胞分化;與丹酚酸B孵育可顯著降低HGMCs中α-SMA表達(dá)水平(P<0.05或P<0.01)，見圖1，提示丹酚酸B可明顯抑制HGMCs向肌成纖維細(xì)胞分化。

2 丹酚酸B對高糖誘導(dǎo)HGMCs ECM分泌的影響

由表1可見，暴露于高糖環(huán)境72 h后，I型膠原、III型膠原、層粘連蛋白及纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的分泌量明顯增加(P<0.01)，而與丹酚酸B共同孵育可顯著降低細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平(P<0.05或P<0.01)。這一結(jié)果提示高糖誘導(dǎo)HGMCs分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強(qiáng)，而丹酚酸B可減少高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)分泌。

Figure 1.The effect of Sal B on the protein levels of α-SMA in the HGMCs. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

圖1丹酚酸B對人腎小球系膜細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的影響

表1 丹酚酸B對高糖誘導(dǎo)HGMCs分泌ECM的影響

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

3 丹酚酸B對高糖誘導(dǎo)的TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

正常培養(yǎng)條件下，HGMCs表達(dá)TGF-β1蛋白極少，而在高糖環(huán)境下培養(yǎng)72 h后，TGF-β1蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01);與丹酚酸B共同孵育可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的TGF-β1蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，見圖2。這一結(jié)果與丹酚酸B抑制高糖誘導(dǎo)α-SMA蛋白表達(dá)的作用一致。

4 丹酚酸B對高糖誘導(dǎo)Smad2磷酸化的影響

暴露于高糖環(huán)境72 h后，HGMCs內(nèi)Smad2的磷酸化水平顯著升高(P<0.01)，這一結(jié)果與高糖誘導(dǎo)TGF-β1水平升高的效應(yīng)一致，提示高糖明顯誘導(dǎo)TGF-β1/Smad信號通路激活;與丹酚酸B共同孵育可使Smad2磷酸化水平明顯下降(P<0.01)，這一結(jié)果與丹酚酸B減少HGMCs細(xì)胞外基質(zhì)分泌作用一致，提示丹酚酸B減少HGMCs細(xì)胞外基質(zhì)分泌與抑制TGF-β1/Smad信號通路激活有關(guān),見圖3。

Figure 2.The effect of Sal B on the protein levels of TGF-β1in the HGMCs. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

圖2丹酚酸B對人腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.The effect of Sal B on the phosphorylation of Smad2 in the HGMCs. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

圖3丹酚酸B對人腎小球系膜細(xì)胞Smad2蛋白磷酸化的影響

5 丹酚酸B對高糖誘導(dǎo)的p38 MAPK活化的影響

正常培養(yǎng)的HGMCs內(nèi)p38 MAPK磷酸化水平較低，而暴露于高糖環(huán)境72 h后，p38 MAPK磷酸化水平顯著升高(P<0.01)，提示高糖明顯誘導(dǎo)了p38 MAPK活化;在丹酚酸B存在的情況下，高糖誘導(dǎo)的p38 MAPK磷酸化水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)，見圖4，提示丹酚酸B可有效抑制高糖誘導(dǎo)的p38 MAPK活化。

Figure 4.The effect of Sal B on the phosphorylation of p38 MAPK in the HGMCs. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

圖4丹酚酸B對人腎小球系膜細(xì)胞p38MAPK蛋白磷酸化的影響

討 論

DN是糖尿病最主要致死原因之一，其主要病理特征是腎臟固有細(xì)胞在各種有害因子刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)分化并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)引起的腎纖維化。高血糖是糖尿病腎病主要危險(xiǎn)因素之一，可明顯加速糖尿病腎病的進(jìn)展，而良好的血糖控制則可有效延緩其發(fā)生發(fā)展[6]。然而，由于健康教育、醫(yī)療服務(wù)和患者治療依從性等多方面因素的影響，目前我國糖尿病患者血糖達(dá)標(biāo)率仍處于較低水平[7]。因此，尋找有效措施防治糖尿病腎纖維化就成為減少糖尿病腎病、改善糖尿病預(yù)后的有效途徑之一。

腎小球系膜細(xì)胞是腎臟固有細(xì)胞之一，位于腎小球毛細(xì)血管袢之間，具有維持腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整性、調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過率及分泌多種細(xì)胞因子如TGF-β1等生物學(xué)功能。在高糖等因素作用下，腎小球系膜細(xì)胞可大量增殖并發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，合成并分泌大量ECM，引起腎纖維化[4]。α-SMA是腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白之一，也是GMCs受損激活和發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志，在多種原因誘導(dǎo)的纖維化腎組織中，α-SMA表達(dá)水平明顯升高[8]。本研究結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)72 h后，HGMCs表達(dá)α-SMA蛋白的水平明顯升高，同時(shí)ColⅠ、ColⅢ、FN和LN等ECM成分分泌也顯著增加，說明高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化并分泌大量ECM成分。與丹酚酸B共同孵育可顯著減少高糖誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)和ECM分泌，這一結(jié)果與丹酚酸B抑制糖尿病大鼠腎纖維化作用一致，提示丹酚酸B改善糖尿病腎纖維化與抑制腎小球系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化并分泌ECM有關(guān)。

TGF-β1是TGF-β超家族一員，廣泛參與組織纖維化、炎癥等多種病理生理過程，其中TGF-β1/Smad信號通路的異常激活是糖尿病腎纖維化的主要機(jī)制之一[9]。當(dāng)TGF-β1與其受體結(jié)合后，受體的激酶活性被激活，后者可使Smad2蛋白發(fā)生磷酸化。活化的Smad2蛋白可與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入胞核，啟動(dòng)I、III型膠原等ECM成分基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)纖維化形成。本研究顯示，正常培養(yǎng)條件下，HGMCs僅表達(dá)少量的TGF-β1，細(xì)胞內(nèi)Smad2蛋白磷酸化水平也較低。在高糖環(huán)境下培養(yǎng)72 h后，TGF-β1表達(dá)和Smad2蛋白磷酸化水平均明顯升高，說明高糖明顯誘導(dǎo)了TGF-β1/Smad信號通路激活。與丹酚酸B共同孵育可有效抑制高糖誘導(dǎo)的TGF-β1蛋白表達(dá)和Smad2蛋白磷酸化，提示丹酚酸B減少HGMCs細(xì)胞外基質(zhì)分泌與抑制TGF-β1/Smad信號通路激活有關(guān)。大量研究顯示，TGF-β1一方面可通過激活Smad信號通路促進(jìn)細(xì)胞分泌ECM成分，另一方面還可通過多種信號途徑誘導(dǎo)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。一旦腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，其合成和分泌ECM成分及TGF-β1的能力將進(jìn)一步增加，形成惡性循環(huán)[10]。本研究顯示丹酚酸B可有效抑制高糖誘導(dǎo)的HGMC表型轉(zhuǎn)化及ECM分泌，并使TGF-β1分泌減少，提示丹酚酸B可能有助于抑制糖尿病腎病腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。

此外，p38 MAPK在糖尿病腎病腎纖維化中也發(fā)揮重要作用[11-12]。TGF-β1可通過p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腎纖維化[13]。在糖尿病腎病患者腎組織中，p38 MAPK磷酸化水平顯著增加，抑制p38 MAPK活化可明顯減輕腎纖維化水平[14]。高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞p38 MAPK活化水平也明顯升高，而抑制p38 MAPK活化可明顯減少膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[15-16]。本研究顯示，高糖條件下培養(yǎng)的HGMCs內(nèi)p38 MAPK活化水平顯著升高，而丹酚酸B可明顯下調(diào)其活化水平，提示抑制p38 MAPK活化可能也是丹酚酸B抑制HGMCs分泌ECM的機(jī)制之一。

綜上所述，丹酚酸B可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，減少ECM成分合成與分泌，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路及p38 MAPK活化有關(guān)。