陽玉潔 袁江 彭小倩 曾佩 徐勇 鄒利 盧祖能 Md Rezaul Karim 王云甫

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種主要由抗乙酰膽堿受體抗體介導、細胞免疫依賴、補體參與的神經肌肉接頭處的自身免疫病，常表現為部分或全身骨骼肌的病態(tài)疲勞。 MG在全球的發(fā)病率為(25～142)/(100萬人·年)。傳統(tǒng)的免疫抑制或糖皮質激素治療雖取得了一定療效，但這些治療手段不僅可引起感染、骨股頭壞死等嚴重并發(fā)癥，而且均不能有效防止疾病的復發(fā)與進展[1-3]。調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Tregs)是具有免疫抑制功能的CD4+效應T細胞亞群，其表型為CD4+CD25+，Tregs能夠抑制自身反應性T細胞和自身反應性B細胞的活化，是維持免疫平衡和自身免疫耐受的關鍵細胞[4]。線粒體是真核細胞進行生物氧化和能量轉換的重要場所，線粒體受損導致活性氧(reactive oxygen speeies，ROS)的釋放和能量代謝紊亂，可造成細胞損傷或促使細胞凋亡。線粒體自噬是一種選擇性清除多余或受損線粒體的自噬過程，這對保持線粒體數量和質量的穩(wěn)定，以及對細胞正常生長和代謝具有非常重要的意義[5]。羰基氰化物間氯苯腙 (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)是一種線粒體氧化呼吸鏈解偶聯劑，其作用機制是使電子載體在電子傳遞鏈的正?；顒酉滦纬傻馁|子濃度梯度解偶聯化，使線粒體去極化從而改變線粒體膜電位，誘導線粒體自噬[6]。環(huán)孢素(cyclosporin A，CsA)可與線粒體膜通透性轉換孔的親環(huán)蛋白D結合，阻斷線粒體膜通透性轉換，調節(jié)線粒體功能及細胞存亡[7]。在線粒體自噬的研究中，CsA常用作線粒體自噬抑制劑。

作者所在課題組前期研究表明，MG患者外周血Tregs線粒體自噬存在明顯異常[8]，但Tregs線粒體自噬異常與MG發(fā)病的相關性及其具體機制尚不可知。本研究通過體外試驗觀察MG患者Tregs線粒體自噬狀態(tài)，旨在探討外周血Tregs線粒體自噬異常參與MG發(fā)病的細胞代謝機制。

1 對象和方法

1.1觀察對象選擇2016年10月至2018年4月作者醫(yī)院收治的MG患者15例，其中男5例，女10例，年齡14.6～69.3歲，平均(39.5±16.9)歲。MG的診斷標準參考2015年發(fā)表的中國MG診斷和治療指南[9]，排除合并重要器官(如心、肝、肺、腎)功能嚴重損害、其他自身免疫病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎等)、惡性腫瘤、嚴重感染、重大手術或嚴重外傷的患者。所有MG患者采血前2周均未給予抗膽堿酯酶藥物、糖皮質激素或免疫抑制劑治療。另選取作者醫(yī)院同期行體檢的15名健康志愿者作為對照組，其中男6名，女9名，年齡24.3～49.6歲，平均(35.6±9.1)歲。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審查，志愿者簽署知情同意書。

1.2主要試劑和儀器淋巴細胞分離液購于天津灝洋華科生物科技有限公司，人CD4+CD25+Tregs分選試劑盒、LD柱、MS柱購于德國Miltemyi Biotec公司，標記抗體FITC-CD4、PE-CD25購于美國BD Biosciences公司，DCFH-DA探針購于美國Sigma公司，JC-10探針購于武漢普蘭德生物技術公司，Mito Tracker Green購于美國Life Technologies公司，RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素及鏈霉素購于Gibco公司， CytoFLEX分析型流式細胞儀為BECKMAN公司產品，SpectraMax Plus384型酶標儀為Molecular Devices公司產品。

1.3方法

1.3.1人外周血單個核細胞(PBMC)的分離：取50 mL無菌注射器吸入肝素鈉潤滑管壁后，采集30 mL外周血，在生物安全柜內稀釋至90 mL；另取3支無菌50 mL離心管，分別加入15 mL淋巴細胞分離液后，沿管壁緩慢加入30 mL稀釋的外周血，以離心力1700g，離心20 min，取白膜層細胞，用PBS洗滌2次后獲得PBMC。

1.3.2Tregs的分離及鑒定：取2 mL PBS重懸PBMC，計數細胞約為(4～5)×107個/mL，以639g離心8 min，去上清，用Buffer重懸后加入適量CD4+T細胞生物素標記的雞尾酒抗體，混勻后4℃避光孵育5 min，加入抗生物素標記磁珠，混勻后4℃避光孵育10 min，細胞懸液過LD柱，分離得到CD4+T細胞。將重懸所得細胞加入適量抗CD25磁珠抗體，混勻后4℃避光孵育15 min后洗滌細胞，離心、去上清后重懸，細胞懸液過MS柱分離得到CD4+CD25+Tregs。FITC-CD4、PE-CD25標記Tregs，流式細胞儀檢測其純度后，以健康人群的Tregs作為對照組，將MG患者的Tregs分為MG組、MG-CCCP組、MG-CsA組。將各組細胞置于37℃、5%(體積分數)CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中MG-CsA組于培養(yǎng)開始時加入5 μmol/L CsA，MG-CCCP組于培養(yǎng)48 h時加入10 μmol/L的CCCP溶液，各組均培養(yǎng)72 h后收集細胞，以639g離心8 min，去上清后備用。

1.3.3Tregs線粒體質量檢測：取1 mmol/L的線粒體綠色熒光探針3 μL置于6 mL不含血清的培養(yǎng)液中混勻，37℃預溫30 min，將各組Tregs分別加入1 mL預溫的線粒體探針工作液，混勻，37℃避光孵育40 min，離心，棄上清后PBS洗滌2遍，用200 μL無血清培養(yǎng)液重懸，流式細胞儀檢測線粒體質量，綠色熒光強度下降的細胞表示細胞受損，計算受損細胞所占比例。

1.3.4比色法檢測Tregs乳酸水平：將100 nmol/μL乳酸標準液10 μL加入到990 μL Buffer中，得到1000 μL 1 nmol/μL的標準液，分別將0、10、20、30、40、50 μL標準液加至96孔板中，各孔分別加Buffer，使終體積為50 μL。將各組細胞用Buffer重懸后分別取50 μL到96孔板中，標準孔和樣本孔各設一個副孔。向每孔中分別加50 μL主反應混合物(Buffer 46 μL、乳酸探針2 μL、Lactate Enzyme Mix 2 μL)，室溫下避光孵育30 min。采用酶標儀檢測570 nm處吸光度〔D(λ)〕值。繪制準曲線，根據標準曲線計算各組乳酸水平。所用Buffer為乳酸檢測試劑盒中的Buffer。

1.3.5Tregs內ROS水平檢測：采用DCFH-DA法進行檢測。空白組加入1 mL無血清培養(yǎng)液重懸，正常對照組、MG組、MG-CCCP組及MG-CsA組加入經無血清培養(yǎng)液稀釋的10 μmol/L DCFH-DA ROS探針1 mL，37℃避光孵育20 min，每隔3 min混勻1次，然后用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，200 μL PBS重懸，采用流式細胞儀檢測各組ROS水平正常的細胞比例以及各組細胞的平均ROS水平。

1.3.6Annexin V+PI染色檢測Tregs凋亡水平：各組細胞經PBS洗滌兩次，1×Buffer重懸，細胞數約為1×106/mL，取100 μL(約1×105個細胞)置5 mL離心管中，各組分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI-PE(PI用于標記碎片和死細胞)，渦旋混勻，25℃避光孵育15 min后向各組分別加400 μL 1×Buffer，流式細胞儀檢測各組細胞中早期凋亡細胞所占比例。所用1×Buffer為凋亡檢測試劑盒中的10×Buffer稀釋所得。

1.4統(tǒng)計學處理以SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，對數據進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，服從正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1Tregs的鑒定磁珠分選得到的CD4+CD25+Tregs經FITC-CD4、PE-CD25抗體標記后鑒定，純度在(93.36±1.87)%之間。結果見圖1。

注：Tregs：調節(jié)性T細胞，圖2～7、表1同；A：散射光雙參數點圖，橫坐標FSC為前向散射光，代表細胞的大小，縱坐標SSC為側向散射光，代表細胞的顆粒度，P1為設門目的細胞群；B：分選后的Tregs經流式細胞檢測的二維散點圖，用十字門將圖分成四象限，Q3-UR象限內為CD4+ CD25+ Tregs所占比例 圖1 Tregs鑒定的流式細胞圖

2.2各組Tregs線粒體質量各組Tregs線粒體受損細胞所占比例比較差異有統(tǒng)計學意義(F=101.25，P<0.01)。與對照組比較，MG組線粒體受損細胞所占比例明顯升高(P<0.05)；與MG組比較，MG-CCCP組線粒體受損細胞所占比例下降，MG-CsA組線粒體受損細胞所占比例升高(均P<0.05)。結果見圖2、3。

注：MG：重癥肌無力，CCCP：羰基氰化物間氯苯腙，CsA：環(huán)孢素；圖3～7、表1同。橫坐標為單個細胞的綠色熒光強度，代表細胞線粒體質量水平，縱坐標為細胞數量，圖中的豎線為分界線，V1R側為線粒體正常細胞比例，V1L側為線粒體受損細胞比例 圖2 各組Tregs線粒體受損細胞所占比例的流式細胞圖

注：aP<0.05 圖3 流式細胞術檢測各組Tregs線粒體受損細胞比例 (n=15)

2.3各組Tregs乳酸水平各組細胞乳酸水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=89.62，P<0.01)。與對照組比較，MG組乳酸水平升高(P<0.05)；與MG組比較，MG-CCCP組乳酸水平降低，MG-CsA組乳酸水平升高(均P<0.05)a。結果見圖4。

注：aP<0.05 圖4 各組Treg細胞乳酸水平比較(n=15)

2.4各組TregsROS水平比較與對照組比較，MG組Tregs平均ROS水平升高，ROS正常細胞比例降低(均P<0.05)；與MG組比較，MG-CCCP組平均ROS水平和ROS正常細胞比例均升高，MG-CsA組平均ROS水平升高，而ROS正常細胞比例降低(均P<0.05)。結果見表1和圖5。

表1 各組Tregs ROS正常細胞比例和平均ROS水平比較

注：ROS：活性氧，圖5同；與對照組比較，aP<0.05；與MG組比較，bP<0.05

2.5各組Tregs凋亡水平各組細胞早期凋亡細胞比例比較差異有統(tǒng)計學意義(F=92.78，P<0.01)。與對照組比較，MG組細胞早期凋亡比例升高(P<0.05)；與MG組相比，MG-CCCP組細胞早期凋亡比例降低，MG-CsA組細胞早期凋亡比例升高(均P<0.05)。結果見圖6、7。

3 討論

ROS是指生物體內與氧代謝有關的含氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱，包括羥自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-·)、過氧化氫(H2O2)及由此衍生的有機過氧化物烷氧基(RO·)和烷過氧基(ROO·)等物質。機體內氧化代謝可不斷形成ROS，在一定時間、空間和限度內ROS有積極的生理作用。線粒體既主要來源于氧化應激反應又是氧化應激的靶向細胞器，線粒體能夠敏感地感受到機體內氧濃度的變化，任何原因引起的氧供不足或機體用氧障礙均會影響線粒體氧化磷酸化過程中電子傳遞鏈的功能，抑制ATP的生成，產生大量ROS[10]。在ROS、能量缺乏、細胞衰老等外界刺激作用下，細胞內線粒體發(fā)生去極化導致損傷，損傷的線粒體被特異性的包裹并進入自噬體中與溶酶體融合，從而完成損傷線粒體降解過程，維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定，此即為線粒體自噬過程[11]。當線粒體自噬減弱時，受損的線粒體堆積，同時將產生的ROS釋放至細胞質中，會引起周邊正常線粒體出現損傷，正反饋產生大量ROS，使線粒體的氧化磷酸化失衡，最終導致廣泛的線粒體損傷，并釋放細胞色素C、凋亡誘導因子等凋亡相關蛋白，影響細胞功能，誘導細胞凋亡[12-13]。

注：橫坐標為單個細胞的綠色熒光強度，代表細胞ROS水平，縱坐標為細胞數量，圖中豎線為分界線，V1L側為ROS水平正常細胞比例，V1R側為ROS水平升高細胞比例 圖5 各組Tregs ROS水平檢測的流式細胞圖

注：Q1-UL象限為核碎片，Q1-UR象限為死亡或晚期凋亡細胞比例，Q1-LL象限為活細胞比例，Q1-LR象限為早期凋亡細胞比例 圖6 各組Tregs凋亡比例檢測的流式細胞二維散點圖

注：aP<0.05 圖7 流式細胞術檢測各組Tregs凋亡比例

Michalek等[14]研究發(fā)現，不同代謝狀態(tài)決定了CD4+T細胞的分化方向，Tregs的分化主要依賴于線粒體脂質氧化供能，有氧糖酵解所占的比例很小。作者所在課題組前期研究發(fā)現，MG患者Tregs的線粒體自噬水平降低[8]，這將導致細胞內多余或受損的線粒體堆積，線粒體質量下降。線粒體是有氧氧化的主要場所，當線粒體受損時，導致有氧氧化能量代謝障礙，激活糖酵解途徑，促進葡萄糖轉化為丙酮酸鹽進而分解為乳酸。

本述研究利用線粒體自噬誘導劑CCCP和線粒體自噬抑制劑CsA體外改變MG患者Tregs線粒體自噬狀態(tài)，結果顯示，與對照組比較，MG組受損線粒體增加，平均ROS水平升高，ROS正常細胞比例降低，細胞凋亡比例增加，糖酵解水平升高；與MG組比較，MG-CCCP組受損線粒體減少，ROS正常細胞比例增加，細胞凋亡減少，糖酵解水平降低，即CCCP可部分糾正MG患者Tregs代謝紊亂，相反，CsA會加劇這種內環(huán)境失調，使Tregs凋亡增加。同時，本研究還發(fā)現，與MG組比較，MG-CCCP組平均ROS水平和ROS正常細胞比例均升高，而MG-CsA組平均ROS水平升高，而ROS正常細胞比例降低，表明ROS具有“好”和“壞”的雙重性。根據其水平、持續(xù)時間可調節(jié)細胞生理或誘導細胞毒性，當哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)依賴性途徑感受到ROS增高的環(huán)境信號后被抑制，其對ULK1-Atg13-FIP200復合體的抑制作用減弱，ULK1-Atg13-FIP200復合體被激活后由胞質轉運至受損線粒體膜結構的特定位置，形成自噬發(fā)生的原核，募集下游的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、LC3等自噬相關蛋白，形成自噬泡，其后經過核化、自噬體形成、與溶酶體融合等過程完成線粒體自噬，及時清除異常線粒體，促進細胞存活；當ROS堆積時，會引起細胞膜脂質過氧化、蛋白質及核酸等的氧化損傷，加速細胞凋亡[15-16]。

綜上所述，本研究發(fā)現，MG患者Tregs的線粒體自噬功能存在異常，導致細胞內多余或受損線粒體堆積，發(fā)生能量代謝障礙，細胞內環(huán)境異常，Tregs凋亡增加，進而可能導致了MG的發(fā)生與發(fā)展。因此，保持正常線粒體自噬功能，適時清除多余或受損線粒體，維持正常代謝水平，是維持Tregs穩(wěn)態(tài)和正常免疫功能的基礎。CCCP作為線粒體特異性的自噬激活劑，可促進線粒體自噬，清除受損線粒體，改善細胞內環(huán)境紊亂，保持Tregs免疫抑制功能的穩(wěn)定。后期作者課題組將在復制 Lewis 大鼠實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis， EAMG)模型的基礎上，經腹腔分別注射經CCCP和CsA處理后的 CD4+CD25+Tregs來動態(tài)觀察EAMG大鼠病情、機體免疫狀態(tài)、Tregs免疫功能變化，進而揭示Tregs的線粒體自噬異常參與MG發(fā)病的細胞代謝-免疫機制，為MG的臨床特異性治療提供實驗和理論依據。