熊燕飛，班宜輝，張建坤，劉 東，徐 鵬，陳 燕

（武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

紫外吸收法定量核酸具有簡便、快速、不破壞樣品等特點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室常用的簡便快速的核酸初步定量方法。該方法以核酸的組成和理化性質(zhì)為基礎(chǔ)，利用分光光度法原理和技術(shù)進(jìn)行定量，為消除小分子光吸收物質(zhì)的干擾，還需進(jìn)行沉淀離心操作，涉及多方面基礎(chǔ)知識(shí)和技術(shù)原理，所以，被不少生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材收錄[1-2]

但該方法受寡核苷酸、核苷酸等小分子紫外吸收物質(zhì)的干擾，為消除這類干擾，采用鉬酸銨-過氯酸沉淀核酸大分子后，測定小分子干擾物質(zhì)的光吸收值進(jìn)行校正[1-2]。實(shí)際測定中發(fā)現(xiàn)，鉬酸銨-過氯酸沉淀劑本身在260 nm處產(chǎn)生一定的紫外吸收，而且其較強(qiáng)的酸性可能導(dǎo)致核酸大分子部分降解，同時(shí)，核苷酸等物質(zhì)在260 nm處的紫外吸收受溶液pH值的影響，這些因素對測定結(jié)果帶來嚴(yán)重影響。筆者對這一方法存在的問題進(jìn)行了分析探討，并提出了改進(jìn)方法。改進(jìn)后，所用試劑更簡單安全，測定結(jié)果比原方法準(zhǔn)確可靠，可用于核酸紫外吸收法定量測定的實(shí)驗(yàn)教學(xué)和核酸定量的一般快速分析檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

小牛胸腺DNA鈉鹽：Sigma公司，Type I。

標(biāo)準(zhǔn)DNA儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取25.0 mg的小牛胸腺DNA鈉鹽，去離子水溶解并定容至25 mL，DNA的濃度為1.0 mg/mL（pH ≈ 6.5）。

標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品液：根據(jù)需要取標(biāo)準(zhǔn)DNA儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度，本試驗(yàn)主要使用100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品溶液。

DNA樣品：常規(guī)氯仿-異戊醇抽提法[3]自制豬肝DNA 3份，均為略帶灰白色固體，分別以1 mol/L NaCI溶液溶成糊狀，加稀NaOH助溶至完全溶解，稀HCl調(diào)pH值至6.5，去離子水定容至25 mL，分別記為樣品溶液Ⅰ、樣品溶液Ⅱ和樣品溶液Ⅲ，其A260/A280分別為2.059、2.048、1.870。

鉬酸銨-過氯酸沉淀劑：0.25%鉬酸銨-2.5%的過氯酸溶液（四水合鉬酸銨、過氯酸均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品）。

島津紫外-可見分光光度計(jì)UV-2500。

高速冷凍離心機(jī)：HERMLE LABORTECHNIK。

1.2 方法

1.2.1 鉬酸銨-過氯酸沉淀劑 1）鉬酸銨-過氯酸的紫外吸收

采用島津紫外-可見分光光度計(jì)UV-2500對沉淀劑及鉬酸銨溶液進(jìn)行全吸收譜掃描，重點(diǎn)檢測其在紫外區(qū)的光吸收情況。

2）鉬酸銨-過氯酸溶液對樣品的影響

試驗(yàn)管：取標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品溶液0.5 mL，加入鉬酸銨-過氯酸沉淀劑0.5 mL，混勻，冰浴沉淀一定時(shí)間，3 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL，去離子水稀釋至5.0 mL，去離子水作參比，測260 nm處光吸收值。

對照管：以去離子水替代沉淀劑，其他同試驗(yàn)管處理，測定光吸收值。

空白沉淀劑管：以去離子水替代樣品，其他同試驗(yàn)管處理，測定光吸收值。

觀察鉬酸銨-過氯酸沉淀劑對測定結(jié)果的影響，分析鉬酸銨-過氯酸沉淀劑對樣品是否產(chǎn)生變性、降解等作用。

3）原方法檢測液稀釋過度

按原方法，樣品經(jīng)沉淀和離心后，上清液由0.4 mL稀釋至50 mL，樣品被稀釋250倍[1]，檢測液中DNA濃度稀釋至0.4～0.5μg/mL，稀釋過度。

1.2.2 改進(jìn)方法 以無水乙醇沉淀樣品中DNA大分子，校正上清液中可溶性小分子物質(zhì)的干擾。對乙醇pH值、用量、沉淀時(shí)間、離心速度、離心時(shí)間等條件進(jìn)行考察。按摩爾磷消光系數(shù)計(jì)算樣品DNA含量，確定乙醇沉淀法的測定條件。

1）乙醇pH值

以稀鹽酸調(diào)節(jié)配制不同pH值的95%的乙醇，以100 μg/mL小牛胸腺DNA鈉鹽溶液為樣品，按下述方法測定樣品DNA含量，根據(jù)測定值確定乙醇沉淀適宜pH值。

試驗(yàn)管：取7組小試管，按樣品溶液與乙醇體積比1∶2的比例加入樣品溶液和不同pH值的乙醇，冰浴中沉淀30 min，高速冷凍離心機(jī)4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL，去離子水稀釋至5.0 mL，去離子水作參比，測上清液在260 nm處的光吸收值，記為A。因溶液的pH值對堿基的光吸收有一定的影響，乙醇在紫外區(qū)產(chǎn)生微弱的光吸收，故按下述方法設(shè)置對照管和空白沉淀劑管。

對照管：以相應(yīng)pH值的去離子水替代乙醇，其他同試驗(yàn)管，260 nm處的光吸收值記為A0。

空白沉淀劑管：以去離子水替代樣品，其他同試驗(yàn)管，260 nm處的光吸收值記為Ai。

按下式計(jì)算DNA含量，確定乙醇適宜pH值。

DNA含量（μg/mL）=（（A0－（A-Ai））/0.02）× 稀釋倍數(shù)。

2）乙醇用量

用1.2.2 1）確定的適宜pH值的乙醇，按不同的樣品溶液∶乙醇體積比進(jìn)行沉淀，分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，加入上述確定的適宜pH值的乙醇，其他處理同方法1.2.2 1），同樣設(shè)置對照管和空白沉淀劑管，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)測定結(jié)果，確定乙醇用量。

3）沉淀時(shí)間

按方法1.2.2 1）及1.2.2 2）確定的乙醇pH值及用量，冰浴條件下，分別沉淀不同時(shí)間，其他處理同方法1.2.2 1），確定沉淀時(shí)間。

4）離心速度

根據(jù)1.2.2 1）、1.2.2 2）、1.2.2 3）確定的乙醇pH值、乙醇用量和冰浴沉淀時(shí)間，4℃下，以不同速度進(jìn)行離心，其他處理同方法1.2.2 1），確定離心速度。

5）離心時(shí)間

按上述確定的試驗(yàn)條件處理，沉淀完成后，于4℃、8 000 r/min分別離心10、20、30 min，確定有效離心時(shí)間。

1.2.3 改進(jìn)方法的穩(wěn)定性及回收試驗(yàn) 以3份自制豬肝DNA樣品溶液和1份小牛胸腺DNA溶液為樣品，每個(gè)樣品測定5次，檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性。

每個(gè)樣品中分別加入不同已知量的小牛胸腺DNA鈉鹽，測定樣品回收率，檢測方法的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品測定3次

5.0 mL自制豬肝DNA樣品溶液Ⅰ，加1.0 mL去離子水，為樣品Ⅰ-1；5.0 mL自制豬肝DNA樣品溶液Ⅰ，加1.0 mL 200 μg/mL小牛胸腺DNA溶液，為回收試驗(yàn)樣品Ⅰ-2。

4.5 mL自制豬肝DNA樣品溶液Ⅱ，加1.5 mL去離子水，為樣品Ⅱ-1；4.5 mL自制豬肝DNA樣品溶液Ⅱ，加1.5 mL 200 μg/mL小牛胸腺DNA溶液，為回收試驗(yàn)樣品Ⅱ-2。

自制豬肝DNA樣品溶液Ⅲ，為樣品Ⅲ-1；20.0 mL自制豬肝DNA樣品溶液Ⅲ，加0.5 mg小牛胸腺DNA鈉鹽固體，搖勻至完全溶解，定容至25 mL，為回收試驗(yàn)樣品Ⅲ-2。

100 μg/mL小牛胸腺DNA鈉鹽溶液4.8 mL，加1.2 mL H2O，為樣品Ⅳ-1，100 μg/mL小牛胸腺DNA鈉鹽溶液4.8 mL，加0.4 mL 200 μg/mL小牛胸腺DNA鈉鹽溶液和0.8 mL H2O，為回收試驗(yàn)樣品Ⅳ-2。

0.5 mL樣品溶液，加pH 3.0的95%乙醇1.0 mL，混勻，冰浴中沉淀40 min，4℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液1.0 mL，去離子水稀釋至5.0 mL，去離子水調(diào)零，測A260，記為A′。參照1.2.2 1）設(shè)對照管和空白溶劑管，測260 nm處的光吸收值分別記為，計(jì)算樣品DNA含量和回收率。

樣品回收率=（（回收樣品DNA量-樣品DNA量）/已知DNA加入量）×100%。

2 結(jié)果

2.1 鉬酸銨-過氯酸沉淀劑存在的問題

2.1.1 鉬酸銨-過氯酸沉淀劑本身的干擾 圖1為稀釋100倍的鉬酸銨-過氯酸沉淀劑的吸收譜，在260 nm處的光吸收值達(dá)0.141 1，為保證目標(biāo)物沉淀完全，沉淀劑通常是過量的，這對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生強(qiáng)烈干擾。

圖1 稀釋100倍的鉬酸銨-過氯酸沉淀劑吸收譜Fig.1 Absorption spectrum of ammonium molybdate-perchloric acid precipitant with 100 times dilution

通過設(shè)置空白沉淀劑管以扣除沉淀劑本身的光吸收，可消除部分干擾，但沉淀目標(biāo)物消耗的沉淀劑量無法確定，由此帶來的誤差不可忽略。此外，沉淀劑本身的吸收值不穩(wěn)定，平行測定的相對偏差較大。

鉬酸銨-過氯酸沉淀劑在紫外區(qū)產(chǎn)生的光吸收主要來自鉬酸銨，如圖2所示，0.25%的鉬酸銨溶液稀釋200倍后在260 nm處的光吸收值達(dá)0.115 1，鉬酸銨溶液產(chǎn)生的紫外吸收較鉬酸銨-過氯酸溶液產(chǎn)生的紫外吸收更強(qiáng)烈。試驗(yàn)中還觀察到，鉬酸銨-過氯酸溶液的pH值約為3，與樣品溶液混合，冰浴沉淀后，溶液pH值下降至2，這種酸性環(huán)境可能導(dǎo)致DNA變性或降解，影響檢測結(jié)果。

圖2 0.25%鉬酸銨溶液稀釋200倍后的吸收譜Fig.2 Absorption spectrum of 0.25%ammonium molybdate solution with 200 times dilution

2.1.2 鉬酸銨-過氯酸沉淀劑對樣品的影響 圖3是鉬酸銨-過氯酸沉淀劑沉淀樣品不同時(shí)間對上清液在260 nm處光吸收產(chǎn)生的影響。圖3顯示，隨著沉淀劑與樣品作用時(shí)間延長，代表小分子干擾物的上清液的A260值呈現(xiàn)輕微增大的趨勢，從20 min延長到60 min，A260從0.573增加到0.622，意味著沉淀劑與DNA大分子作用不穩(wěn)定，或沉淀物不穩(wěn)定，或?qū)е翫NA變性甚至降解，對最終結(jié)果產(chǎn)生影響。

圖3 鉬酸銨-過氯酸沉淀樣品時(shí)間對上清液A260值的影響Fig.3 Effect of precipitation time with ammonium molybdate-perchloric acid onA260value of supernatant

2.1.3 原方法過度稀釋使測量誤差增大 原方法中，樣品經(jīng)一系列處理，最后進(jìn)行光吸收值測定的溶液，共稀釋250倍，假設(shè)光吸收值讀數(shù)至少達(dá)到0.1，則原樣品濃度至少需要達(dá)到1.25 mg/mL。文獻(xiàn)[1]提到，樣品濃度達(dá)到5 mg/mL DNA，最后測定液中樣品共被稀釋200倍，即使樣品為純DNA，對照管溶液讀數(shù)也只有0.5左右。多數(shù)情況下能夠獲得的DNA樣品很少，難以配成高濃度溶液。同時(shí)也浪費(fèi)樣品。

總之，鉬酸銨-過氯酸作為沉淀劑會(huì)對試驗(yàn)產(chǎn)生較大干擾，而且這種干擾難以消除，有必要對原測定方法進(jìn)行改進(jìn)。

2.2 改進(jìn)方法

以無水乙醇代替鉬酸銨-過氯酸作為沉淀劑，通過單因素分析，逐一確定新方法的測定條件。

2.2.1 乙醇沉淀DNA的適宜pH值 以100 μg/mL小牛胸腺DNA鈉鹽溶液為樣品，按1.2.2 1）方法，以pH值分別為5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0的乙醇作為沉淀劑，測得樣品的DNA含量見表1。

表1 不同pH值乙醇作沉淀劑測定的DNA含量（±s）Tab.1 DNA content determined with ethanol as precipitant with different pH

表1 不同pH值乙醇作沉淀劑測定的DNA含量（±s）Tab.1 DNA content determined with ethanol as precipitant with different pH

2.0 88.5±4.5 11.5 DNA含量和相對誤差DNA含量/（μg·mL-1）相對誤差/%5.0 74.8±11.5 25.2 4.5 83.8±10.2 16.2 4.0 86.1±4.7 13.9 pH值3.5 93.3±3.4 6.7 3.0 95.8±2.9 4.2 2.5 87.3±3.0 12.7

由表1可見，以pH 3.0～3.5的乙醇沉淀DNA大分子以校正小分子物質(zhì)干擾時(shí)，可獲得較好結(jié)果，誤差可以控制在5%左右，pH值繼續(xù)降低，測定結(jié)果趨于減小，誤差增大。故以下試驗(yàn)采用pH 3.0的95%乙醇作為沉淀劑。

2.2.2 乙醇用量 以不同用量的pH 3.0的乙醇沉淀時(shí)，測得樣品DNA含量見表2。

表2 不同乙醇用量時(shí)測定的DNA含量（±s）Tab.2 DNA content determined with ethanol as precipitant with different amounts

表2 不同乙醇用量時(shí)測定的DNA含量（±s）Tab.2 DNA content determined with ethanol as precipitant with different amounts

1∶5 95.0±2.9 5.0 DNA含量和相對誤差DNA含量/（μg·mL-1）相對誤差%1∶1 80.3±9.3 19.7 1∶2 95.7±3.4 4.3樣品∶乙醇體積比1∶3 96.0±4.1 4.0 1∶4 95.8±5.6 4.2

由表2可見，試驗(yàn)條件下，乙醇用量達(dá)到2倍體積后，所得結(jié)果無明顯差異，即2倍體積pH 3.0的95%的乙醇即可使大分子DNA基本沉淀，繼續(xù)增大乙醇用量，有利于DNA大分子沉淀，但意義不大，故選擇2倍體積的pH 3.0的95%乙醇作為沉淀劑。

2.2.3 沉淀時(shí)間 以2倍體積的pH 3.0的95%的乙醇分別沉淀樣品20、30、40、50、60 min時(shí)，測定結(jié)果見表3。

表3 乙醇沉淀不同時(shí)間所測定的DNA含量（±s）Tab.3 DNA content determined with ethanol as precipitant with different precipitation time

表3 乙醇沉淀不同時(shí)間所測定的DNA含量（±s）Tab.3 DNA content determined with ethanol as precipitant with different precipitation time

60 96.0±3.2 4.0 DNA含量和相對誤差DNA含量/（μg·mL-1）相對誤差/%20 88.5±4.7 11.5 30 95.5±3.1 4.5沉淀時(shí)間/min 40 96.0±3.5 4.0 50 95.7±2.2 4.3

表3數(shù)據(jù)顯示，隨著沉淀時(shí)間延長，測定誤差減小，冰浴沉淀30 min即可使大分子DNA沉淀完全，測定誤差小于5%，繼續(xù)延長時(shí)間，對沉淀DNA大分子影響不明顯，為保證沉淀完全，以下試驗(yàn)選擇沉淀40 min。

2.2.4 離心速度 沉淀完成后，采用不同速度離心，測定結(jié)果見表4。

表4 不同離心速度時(shí)所測DNA含量（±s）Tab.4 DNA content determined with different centrifugation speeds

表4 不同離心速度時(shí)所測DNA含量（±s）Tab.4 DNA content determined with different centrifugation speeds

10 000 DNA含量和相對誤差5 000離心速度/（r·min-1）6 0007 0008 0009 000 DNA含量/（μg·mL-1）相對誤差/%95.5±4.8 4.5 96.0±4.0 4.0 96.0±3.4 4.0 97.0±4.3 3.0 96.9±1.7 3.5 97.1±3.4 4.0

由表4數(shù)據(jù)可知，在考察的離心速度下所得結(jié)果誤差均小于5%，考慮到對設(shè)備的要求，選擇轉(zhuǎn)速8 000 r/min進(jìn)行離心。

2.2.5 離心時(shí)間 pH 3.0的95%的乙醇作為沉淀劑，沉淀時(shí)間為40 min，離心速度8 000 r/min，離心時(shí)間分別為10、20、30 min，測得DNA含量見表5。

表5 離心不同時(shí)間時(shí)測得DNA含量（±s）Tab.5 DNA content determined with different centrifugation time

表5 離心不同時(shí)間時(shí)測得DNA含量（±s）Tab.5 DNA content determined with different centrifugation time

30 96.80±2.9 3.2 DNA含量和相對誤差DNA含量/（μg·mL-1）相對誤差/%10 95.8±1.7 4.2離心時(shí)間/min 20 96.2±2.4 3.8

由表5數(shù)據(jù)可知，離心時(shí)間為10 min時(shí)，測定結(jié)果為95.8 μg/mL，誤差4.2%，基本可將DNA大分子沉淀。實(shí)際操作時(shí)，可根據(jù)混合溶液多少，選擇離心10～20 min。

2.3 改進(jìn)方法的穩(wěn)定性及回收試驗(yàn)

按上述確定的測定條件，以2倍體積、pH 3.0的95%乙醇作為沉淀劑，冰浴沉淀40 min，4℃、8 000 r/min離心10 min，對1.2.3中設(shè)計(jì)的8個(gè)樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見表6。

表6 方法穩(wěn)定性試驗(yàn)及回收試驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.6 Method stability test and recycling test

表6 方法穩(wěn)定性試驗(yàn)及回收試驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.6 Method stability test and recycling test

DNA含量和回收率DNA含量/（μg·mL-1）回收率/%平均回收率/%Ⅰ-1 141.8±3.3Ⅱ-1 156.3±3.5Ⅲ-1 74.7±5.1樣品Ⅳ-1 114.8±2.7Ⅰ-2 175.3±2.2 100.5±3.4Ⅱ-2 205.0±1.6 97.0±3.8Ⅲ-2 87.5±3.4 95.2±5.6Ⅳ-2 358.8±3.8 97.6±1.8 97.7±2.1

表6中數(shù)據(jù)顯示，改進(jìn)后，4組樣品測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差最高5.1 μg/mL，樣品回收率（97.7±2.1）%，方法準(zhǔn)確度和精密度均可以滿足一般常量和半微量生化組分的檢測要求。其中，樣品Ⅲ-2檢測誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差相對較大，主要是Ⅲ-2樣品濃度較低，濃度為93.3 μg/mL。在低濃度時(shí)，一方面沉淀不完全導(dǎo)致結(jié)果偏低，相對誤差較大，另一方面，讀數(shù)誤差不可忽視，致使最終檢測結(jié)果的相對誤差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均較大。

通過對酸性乙醇的沉淀效果和沉淀?xiàng)l件的考察，筆者提出了在DNA紫外吸收定量分析中，校正寡核苷酸等可溶性物質(zhì)干擾的改進(jìn)方法，即采用pH 3.0的95%乙醇作沉淀劑，按樣品∶酸性乙醇體積比1∶2的用量，冰浴沉淀40 min，4℃、8 000 r/min離心10～20 min，取上清液稀釋10倍，去離子水調(diào)零，測260 nm處光吸收值，同時(shí)設(shè)對照管和空白沉淀劑管，扣除空白沉淀劑的吸收值后，根據(jù)對照管與試驗(yàn)管的吸光值差值和稀釋倍數(shù)計(jì)算DNA大分子含量。

酸性乙醇在260 nm處的光吸收值很小，對于濃度較大或要求不高的樣品可不設(shè)空白沉淀劑管。該方法可測定DNA濃度在100 μg/mL以上的樣品，相對誤差可控值在5%以內(nèi)，樣品濃度過低則誤差較大。

3 討論

原紫外吸收法定量檢測DNA時(shí)，采用鉬酸銨-過氯酸沉淀核酸大分子，檢測上清液的光吸收值，以校正可溶性小分子物質(zhì)的干擾，所用沉淀劑鉬酸銨-過氯酸因自身存在紫外吸收而嚴(yán)重干擾檢測結(jié)果，同時(shí)，可能存在對核酸的破壞作用、方法不穩(wěn)定、重現(xiàn)性很差等問題。

改進(jìn)后的方法不僅避免了沉淀劑對測定結(jié)果的影響，同時(shí)具有以下優(yōu)點(diǎn)：所用試劑簡單、安全、操作方便；對儀器設(shè)備要求低；不破壞樣品，必要時(shí)可去除乙醇對核酸進(jìn)行復(fù)性，回收樣品；直接根據(jù)核酸的摩爾磷消光系數(shù)ε（P）進(jìn)行核酸含量的計(jì)算，無需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)參比；因此，用于核酸的常規(guī)定量十分便利。

由于DNA的摩爾吸光系數(shù)僅1 000數(shù)量級(jí)，靈敏度較低，因此，本方法不適合微量或痕量DNA片段的檢出或要求較高的樣品檢測，對核酸濃度大于75 μg/mL的樣品測定結(jié)果較準(zhǔn)確。測定誤差主要來自以下幾方面：1）乙醇對核酸大分子的沉淀作用不完全，特別是樣品濃度較低時(shí)，因沉淀不完全引起的誤差較大，應(yīng)盡量控制樣品濃度在100 μg/mL以上；2）乙醇可沉淀RNA和蛋白質(zhì)等大分子，如樣品含有RNA或蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，將使測定結(jié)果偏高，可預(yù)先通過A260/A280加以判斷，對樣品進(jìn)一步純化，去除RNA或蛋白質(zhì)，這是紫外吸收法測定核酸存在的共同問題。

隨著核酸技術(shù)的發(fā)展，核酸定量檢測技術(shù)的研究也不斷向著高通量、高靈敏度和高特異性的方向發(fā)展，熒光染料法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[4]、數(shù)字定量PCR法[5]、共振光散射法[6]等各種相對定量與絕對定量方法逐步建立并完善起來，為核酸的快速高通量檢測提供了更靈敏的方法。但這些方法均依賴于特殊的儀器設(shè)備，不太適合于基礎(chǔ)學(xué)科教學(xué)，并難以普及，核酸紫外吸收定量檢測方法在基礎(chǔ)學(xué)科教學(xué)中仍具有很好的實(shí)用意義。

致謝：本研究得到武漢理工大學(xué)生物技術(shù)系郭海英老師和劉念博士的大力支持和幫助，并在多屆武漢理工大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)學(xué)生參與的課外研究討論下完成，在此，一并表示衷心的感謝！