吳假假綜述，許利劍審校

0 引 言

胃癌在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位列第四，在世界癌癥死亡人數(shù)中排名第三［1］。盡管近來(lái)手術(shù)技術(shù)的改善及聯(lián)合化療的治療策略［2］，然而腫瘤分子多樣性造成的高臨床異質(zhì)性，甚至具有相似的臨床特點(diǎn)及病理特征［3］，胃癌5年總體生存率依然很低；由此看出，早期診斷、早期治療，尋找有效的生物標(biāo)志物就至關(guān)重要，近年關(guān)于circRNA在胃癌中的異常表達(dá)涌現(xiàn)一些研究，可能會(huì)對(duì)胃癌診斷及治療有意義，本文就此進(jìn)行綜述，為胃癌患者的早期診斷、臨床治療及預(yù)后判斷提供新的理論依據(jù)。

1 circRNA的概述

1.1 概念環(huán)狀RNA（circRNA）是一類閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，無(wú)3′端polyA結(jié)構(gòu)及5′端帽狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度在幾百到幾千不等，不受RNA外切酶降解，穩(wěn)定且廣泛地存在于生物界，具有進(jìn)化保守性［4］。circRNA在20世紀(jì)70年代即被發(fā)現(xiàn)，1979年，Hsu和Coca-Pra?dos報(bào)道利用電子顯微鏡在真核生物細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了circRNA［5］，同時(shí)也開(kāi)啟了該類RNA 的研究歷程。

1.2 circRNA的初步認(rèn)識(shí)由于科學(xué)技術(shù)水平的限制，之前一直以為circRNA是基因錯(cuò)誤轉(zhuǎn)錄及mRNA 加工的副產(chǎn)品［6］；在 2013 年，Jeck 等［7］在《RNA》發(fā)文提出circRNA發(fā)生的兩種模型：套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化；內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化，表明circRNA不是簡(jiǎn)單的錯(cuò)誤剪接。另外研究表明circRNA可存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、血清外泌體以及唾液當(dāng)中［8］。隨后人們陸續(xù)在酵母線粒體、丁型肝炎病毒中發(fā)現(xiàn)cir?cRNA，也發(fā)現(xiàn)在小鼠的睪丸內(nèi)含有性別決定基因（sex-determining region Y，Sry）轉(zhuǎn)錄而來(lái)的circRNA，還證實(shí)了circRNA也存在于人體細(xì)胞［9］，由此看來(lái)，circRNA廣泛并穩(wěn)定的存在于真核生物中。

2 circRNA形成及功能

2.1 circRNA形成circRNA根據(jù)來(lái)源分為：外顯子序列形成的circRNA（ecircRNA）［7］、內(nèi)含子序列形成的circRNA（ciRNA）［10］、內(nèi)含子和外顯子共同形成的circRNA（EIciRNA）［11］。在形成circRNA期間，特異性序列是保守的，并且來(lái)自上游和下游區(qū)域的序列沿相反方向連接在一起，所有這些都通過(guò)反向剪接有助于成熟的circRNA［12］。雖然反向剪接的效率遠(yuǎn)低于線性RNA，但由于其穩(wěn)定性和相對(duì)較長(zhǎng)的半衰期，仍然存在大量的circRNAs。反向剪接機(jī)制取決于互補(bǔ)內(nèi)含子匹配［13］，它在circRNA形成過(guò)程發(fā)揮重要作用。在該機(jī)制中，環(huán)形RNA的兩側(cè)具有特殊的重復(fù)序列，如Alu和其他短序列［14］。CircRNA前體的成環(huán)區(qū)域兩側(cè)的外顯子序列因重復(fù)序列（如Alu）發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)成環(huán)，此后，在U6和U2的作用下，拼接體與成環(huán)的RNA前體結(jié)合，在蛋白復(fù)合物和U5核心的協(xié)同作用下，選擇性地剪切循環(huán)區(qū)域中的外顯子，同時(shí)，外顯子連接區(qū)序列也被反向切割，形成成熟的circRNA［15］。內(nèi)含子circRNA形成的機(jī)制與外顯子circRNA的機(jī)制不同。內(nèi)含子circRNA的形成依賴于5′剪切位點(diǎn)附近的富含GU的序列和靠近分支點(diǎn)的核苷酸C富集序列。兩個(gè)片段首先結(jié)合成環(huán)狀，然后通過(guò)拼接體剪切結(jié)合部分中的外顯子序列和內(nèi)含子序列，其余內(nèi)含子最終被拼接在一起形成成熟的 circRNA［9］。最近，Li等［11］發(fā)現(xiàn)另外一種新型的circRNA由外顯子和內(nèi)含子組成，根據(jù)其互補(bǔ)序列過(guò)表達(dá)，然而精確的拼接機(jī)制尚未確定。

2.2 circRNA功能研究發(fā)現(xiàn)circRNA可能通過(guò)以下幾種方式發(fā)揮其生物學(xué)功能：

2.2.1 競(jìng)爭(zhēng)的內(nèi)源性RNA或miRNA海綿 研究已經(jīng)證明，circRNACDR1as或 ciRS-7［4，16］，circ-SRY［16］，circ-ITCH［17］，circ-HIPK3［14］能夠起到miRNA海綿的作用。例如，首次觀察到一個(gè)充當(dāng)miRNA海綿的circRNA是CDR1as，其具有70多個(gè)保守的miRNA-7的結(jié)合位點(diǎn)［18］。此外，circ-SRY是一種在小鼠睪丸中特異性表達(dá)的circRNA，與miRNA-138具有16個(gè)結(jié)合位點(diǎn)［16，19］。

2.2.2 與RNA結(jié)合蛋白相互作用 除了miRNA海綿的功能外，circRNA還可以與RNA結(jié)合蛋白相互作用，如 circFoxo3 和 circ-MBL（muscleblind）［20-21］。CircFoxo3能夠與許多類型的蛋白質(zhì)結(jié)合，它可以通過(guò)與CDK2和p21相互作用來(lái)抑制細(xì)胞周期并阻止從G1到S期的轉(zhuǎn)變［21］。另外，研究人員發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子序列形成的circRNA可以在細(xì)胞質(zhì)中積累，并與蛋白TDP43結(jié)合，抑制ALS（肌萎縮性側(cè)索硬化）中的TDP43毒性［22］。

2.2.3 調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性 一些circRNA可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。例如，來(lái)自CDR1as的環(huán)狀反義RNA可以與mRNA形成雙鏈體結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定［23］。此外，在小鼠巨噬細(xì)胞中，circ-RasGEF1B可以增強(qiáng)ICAM-1mRNA的穩(wěn)定性［24］。

2.2.4 調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄 circRNA也可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。例如，兩種外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA如circ-EIF3J和circ-PAIP2都可以與U1 snRNP結(jié)合以進(jìn)一步與RNA Pol II相互作用并增強(qiáng)親本基因在HeLa和HEK293細(xì)胞中的表達(dá)［11］，因此外顯子和內(nèi)含子共同組成的circRNA（EIciRNAs）可以在正反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。CiRNA也可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。研究人員發(fā)現(xiàn)，ci-ankrd52和ci-sirt7也可以通過(guò)與Pol II相互作用可以作為其親本基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控因子［10］。這表明內(nèi)含子circRNA也可以調(diào)節(jié)親代基因轉(zhuǎn)錄。

2.2.5 翻譯蛋白質(zhì) 內(nèi)源性circRNA被證明能夠被翻譯成蛋白質(zhì)。 Legnini等［25］發(fā)現(xiàn)在 IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)）驅(qū)動(dòng)下，circ-ZNF609可以翻譯小鼠成肌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。在這個(gè)令人信服的證據(jù)出來(lái)之前，大多數(shù)研究人員認(rèn)為circRNA是一類獨(dú)特的內(nèi)源性非編碼RNA。然而發(fā)現(xiàn)能夠翻譯蛋白質(zhì)的第一個(gè)circRNA是甲型肝炎病毒的基因組，該類病毒是一種單鏈環(huán)狀RNA，其可以產(chǎn)生122個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)［26］。一些報(bào)告顯示，在起始密碼子上游具有IRES序列的人工環(huán)狀RNA可以在體外翻譯功能性GFP（綠色熒光蛋白）［27］。其他研究表明，具有多個(gè)FLAG編碼序列的合成環(huán)狀RNA也可以在不存在用于內(nèi)部核糖體進(jìn)入的任何特定元件的情況下通過(guò)類似于滾環(huán)擴(kuò)增的機(jī)制翻譯蛋白質(zhì)［28］。該發(fā)現(xiàn)使得circRNA具有新的功能，為今后的circRNA研究提供了新的方向。

3 circRNA在胃癌中的異常表達(dá)

Li 等［29］報(bào) 到 一 種 典 型 的 circRNA：cir?cRNA002059，在胃癌組織中，circRNA002059的水平比鄰近的正常組織顯著下調(diào)，還揭示了circRNA的低水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，表明circRNA在胃癌組織中異常表達(dá)，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

3.1 胃癌中上調(diào)的circRNA

3.1.1 CircPVT1 Chen等［30］通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)胃癌組織和相鄰正常組織中circPVT1的表達(dá)，結(jié)果表明，胃癌組織中的circPVT1表達(dá)明顯高于對(duì)照組相鄰正常組織。CircPVT1通過(guò)作為海綿抗miR-125家族成員促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，除了促進(jìn)胃癌生長(zhǎng)，功能研究進(jìn)一步證實(shí)了circPVT1在胃癌中高度表達(dá)是胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo).

3.1.2 circRNA0047905、0138960、769015 Lai等［31］通 過(guò) 分 析 RT-PCR 實(shí) 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) ，證 實(shí) 了 cir?cRNA0047905，circRNA0138960和circRNA7690-15在胃癌組織中顯著上調(diào)，其機(jī)制可能為調(diào)節(jié)親本基因如SERPINBmRNA、GDAmRNA的表達(dá)。他們通過(guò)繪制一個(gè)接收機(jī)工作特性曲線進(jìn)一步評(píng)估了這3種環(huán)狀RNA的診斷價(jià)值。我們發(fā)現(xiàn)cir?cRNA0047905曲線下面積（AUC）為 0.85（95%CI：0.751-0.950），表明circRNA0047905的診斷準(zhǔn)確度最高。circRNA0138960和circRNA7690-15具有較低的診斷準(zhǔn)確性，circRNA0138960和circRNA7690-15的 AUC 分別為 0.647（95%CI：0.508-0.786）和0.681（95%CI：0.546-0.815）。

3.2 胃癌中下調(diào)的circRNA

3.2.1 circRNA0000745 其由精子抗原與calponin同源性和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域1基因編碼形成，位于chr17：20107654-20109225。Huang 等［32］研究發(fā)現(xiàn)circRNA0000745在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，下調(diào)機(jī)制可能與其可綁定一系列miRNA相關(guān)，其表達(dá)水平與腫瘤類型有關(guān)，circRNA0000745的ROC曲線下面積（AUC）在血漿中為0.683，若結(jié)合癌胚抗原，AUC增加至0.775，表明具有良好的診斷價(jià)值，但仍未發(fā)現(xiàn)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值，具體與腫瘤的病理學(xué)特點(diǎn)仍需進(jìn)一步探索。

3.2.2 circRNA100269 CircRNA100269是染色體1的GRCh38.p7的外顯子circRNA轉(zhuǎn)錄物，Zhang等［33］發(fā)現(xiàn)CircRNA100269在胃癌中下調(diào)，通過(guò)靶向miR-630抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，兩者在胃癌組織中呈負(fù)相關(guān)，表明circRNA極有可能成為胃癌早期診斷和預(yù)后的穩(wěn)定的腫瘤標(biāo)志物。

3.2.3 circRNA LARP4 Zhang等［34］發(fā)現(xiàn) circRNA LARP4在胃癌中抑制細(xì)胞增殖與侵襲，機(jī)制是通過(guò)海綿狀miR-424-5p和調(diào)節(jié)LATS1表達(dá)，高miR-424-5p的表達(dá)或LATS1低表達(dá)與胃癌患者的病理分期，總體生存率呈正相關(guān)，miR-424通過(guò)靶向LATS1基因促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲，證明circLARP4起到腫瘤抑制作用，進(jìn)一步確定了致癌miR-424與LATS1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這可能在腫瘤診斷、預(yù)后和治療上作為新穎的生物標(biāo)志物。

3.2.4 circRNA0001649 Li等［35］研究 表 明 ，cir?cRNA0001649在胃癌組織及血清中均下調(diào)（P值＜0.01），可能與胃癌類型有關(guān)，具有相對(duì)較高的敏感性及特異性，可能作為篩查胃癌的生物標(biāo)志物，但具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

3.2.5 circRNA104916 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)CircBase發(fā)現(xiàn)circ-104916是從染色體區(qū)域9q33.3生成的，該區(qū)域由NEK6的外顯子1、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6和外顯子8反向剪接。成熟circ-104916轉(zhuǎn)錄物是651nt的環(huán)狀RNA分子［36］。Li等［37］通過(guò)微陣列分析研究發(fā)現(xiàn)circRNA104916通過(guò)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制腫瘤細(xì)胞，分子表達(dá)水平與腫瘤入侵深度、分期、淋巴轉(zhuǎn)移及神經(jīng)侵襲有關(guān)，另外miR-7間接靶向 FAK 上調(diào) E-鈣粘蛋白和 IGF1R［38-39］，從而降低上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變，減少不依賴貼壁的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制，總結(jié)以上，circRNA104916可能通過(guò)靶向miR-7發(fā)揮作用，可見(jiàn)，CircRNA可成為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)和潛在的胃癌生物標(biāo)記。

3.3 circRNA與胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)已經(jīng)有報(bào)道稱cir?cPVT1，circ0000190 和 4 個(gè) 基 于 circRNA（ cir?cRNA101308、circRNA104423、circRNA104916和circRNA100269）的分類器是胃癌患者生存和復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物［30，40］。胃癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式是以個(gè)人為基礎(chǔ)建立的（1.434×circRNA101308的狀態(tài)）-（0.917×circRNA104423的狀態(tài)）-（1.042×cir?cRNA104916的狀態(tài)）-（1.201×circRNA100269的狀態(tài)），其中高表達(dá)狀態(tài)等于1而低表達(dá)狀態(tài)等于0。臨界值是由X-tile軟件計(jì)算的“-1”。當(dāng)危險(xiǎn)評(píng)分高于臨界值時(shí)，將患者納入高危組。否則，患者被納入低風(fēng)險(xiǎn)組。使用這個(gè)分類器，我們可以從高風(fēng)險(xiǎn)的胃癌患者中區(qū)分早期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低的患者。

3.4 作為胃癌生物標(biāo)志物生物標(biāo)志物被定義為可以在血液，體液或組織中發(fā)現(xiàn)的生物實(shí)體，其可以是正?；虍惓＿^(guò)程或病癥或疾病的征兆。生物標(biāo)志物的使用已經(jīng)成為早期檢測(cè)和診斷不同疾病以及衡量對(duì)某些治療方法的反應(yīng)的手段。以下幾個(gè)特征使其適合臨床使用，①穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)：大多數(shù)circRNA顯示出半衰期48 h，mRNA的平均半衰期為10 h［41］。不像線性 RNA，3′和 5′末端不暴露在 cir?cRNA中；因此，它們對(duì)核糖核酸酶（如核酸外切酶或核糖核酸酶R）不敏感，并且具有較長(zhǎng)的半衰期；②組織特異性：根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，來(lái)自Rmst和Klhl2的環(huán)狀RNA在小鼠腦中高度表達(dá)，但不在肝臟或肺中表達(dá)［42］。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，circRNA在組織、血清、尿液中更穩(wěn)定，從數(shù)千個(gè)circRNA篩選敏感和特異性分子生物的可能性也更大。通過(guò)RT-PCR和原位雜交測(cè)試circRNA也比通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)蛋白質(zhì)更靈敏，與相鄰非腫瘤組織相比，circRNA在胃癌組織中上調(diào)或下調(diào)，通過(guò)將其與各種其他生物標(biāo)志物組合，從而提高診斷的準(zhǔn)確性和特異性。

3.5 可能作為胃癌靶向治療目標(biāo)腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響腫瘤患者結(jié)局的重要因素，而circRNA與胃癌上述臨床病理因素相關(guān)，大膽預(yù)測(cè)各種CircRNA可作為胃癌治療的靶點(diǎn)，要么減少功能轉(zhuǎn)錄物的循環(huán)，要么使用“mRNA陷阱”來(lái)阻斷轉(zhuǎn)錄本中功能失調(diào)的外顯子［18，41］。在細(xì)胞中循環(huán)miRNA海綿是基于RNA的癌癥治療新的候選者。研究人員最近報(bào)道，一種環(huán)狀的人造miRNA海綿可能會(huì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的miRNA功能喪失［43］。Liu等［43］構(gòu)建了包含來(lái)自T4噬菌體基因td的第I組內(nèi)含子的置換的內(nèi)含子-外顯子序列并產(chǎn)生針對(duì)miR-21和miR-221的環(huán)狀miRNA海綿的環(huán)狀miRNA海綿表達(dá)載體。作為表達(dá)線性海綿的替代載體，本研究中描述的RNA的表達(dá)載體開(kāi)辟了新的方式來(lái)提供具有持久效應(yīng)的miRNA海綿，并且具有巨大的癌癥研究和治療潛力。ciRS-7作為強(qiáng)有力的環(huán)狀miR-7海綿起作用，其含有多個(gè)結(jié)合miR-7的miRNA反應(yīng)元件［44］。因此，它可以瞬間結(jié)合或釋放大量的miR-7分子，從而有效調(diào)節(jié)疾病網(wǎng)絡(luò)［45］。由此可以看出，雖然靶向circRNA與人類疾病尚處于起步階段，但隨著對(duì)circRNA研究的深入，肯定會(huì)為胃癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

CircRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型分子。它們不再被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤的產(chǎn)物。相反，由于其重要的功能，它們已成為miRNA和lncRNA后最受歡迎的研究課題［46］，它們可能在基因表達(dá)和信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，并參與一些疾病的發(fā)展。如上所述，circRNA已顯示出巨大的疾病診斷與治療的潛力［47］。目前，臨床中使用的分子生物標(biāo)志物總是具有低器官特異性。例如，CEA在消化道腫瘤中很常見(jiàn)，而CA19-9在各種腺癌中很常見(jiàn)。如果將cir?cRNA作為胃癌的生物標(biāo)志物用于臨床，它們的特異性表達(dá)可能有助于解決現(xiàn)有標(biāo)志物的低器官特異性問(wèn)題。然而，circRNA在診斷上也具有一些缺點(diǎn)。首先，檢測(cè)組織或外泌體中的circRNA比現(xiàn)有檢測(cè)更昂貴，這限制了circRNA作為生物標(biāo)志物的廣泛使用；第二，使用circRNA進(jìn)行診斷的可靠性仍然需要被證明?，F(xiàn)在盡管對(duì)circRNA的產(chǎn)生及其確定的功能有了初步的了解，但仍需要大量的研究，相信在不久的將來(lái)circRNA會(huì)在胃癌預(yù)防、診斷和治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。