陳浩 張皓潔 師亮 李瀅昊 任衍康 景瑋 王燕宏 李新毅○☆

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是以中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元漸進(jìn)性減少為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病。近年來研究顯示：小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的腦內(nèi)炎癥與DA能神經(jīng)元的丟失關(guān)系密切[1-2]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide，iNOS）是炎癥反應(yīng)主要的限速酶；NF-кB則是炎癥信號通路關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[3]。最新研究[4]顯示：中藥甘草的主要成分——甘草黃酮（glabridin，Gla）可減少PD小鼠中腦 DA能神經(jīng)元的丟失，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究用 PD造模劑脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）處理體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，模擬腦內(nèi)炎癥環(huán)境，觀察Gla對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS和NF-кB表達(dá)影響，以期明確Gla神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象采用DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞（上海容創(chuàng)生物），置于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整濃度至4×105個/mL，接種于細(xì)胞爬片和24孔板，加DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后隨機(jī)分4組：Control組、LPS 組、3 μg/mL 和 5 μg/mL Gla處理組。 每組設(shè)6個復(fù)孔。Control組不進(jìn)行藥物處理；LPS組用1.0 μg/mL LPS（Sigma）處理 12 h；Gla 處理組分別用 3 μg/mL 和 5 μg/mL Gla（中國食藥檢驗院）預(yù)處理BV-2細(xì)胞 2 h，再加 1.0 μg/mL LPS處理12h。

1.2 iNOS免疫熒光染色用4%多聚甲醛將培養(yǎng)的細(xì)胞爬片固定20 min，沖洗3次后，用山羊血清室溫保濕封閉40 min，傾去不要沖洗，直接滴加iNOS 抗體（1:500，Neomarkers，兔單克隆抗體），4℃孵育過夜。次日沖洗后，滴加山羊抗兔IgG-FITC(1:150，武漢博士德生物)，室溫保濕孵育1 h，沖洗3次，DAPI復(fù)染后，用水與甘油混合液封片，熒光顯微鏡下觀察照相，采用IPP（6.0版本）圖像軟件計數(shù)iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.3 iNOS和NF-кB p65免疫蛋白印跡按照上述分組處理完成后，收集各組細(xì)胞，用核-漿蛋白提取試劑盒（南京凱基生物）分別提取胞漿蛋白和胞核蛋白，并進(jìn)行蛋白定量。取樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，據(jù)分子量切取條帶，脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加iNOS 抗體 （1:800） 和 NF-кB p65 抗體（1:200，CST，兔多克隆抗體），胞漿蛋白內(nèi)參為β-actin（1:1000，CST，兔多克隆抗體），胞核蛋白內(nèi)參為PARP（1:500，上海生工，兔多克隆抗體），4℃孵育過夜，再滴加山羊抗兔IgG（1:500，武漢博士德生物），室溫2 h，發(fā)光劑顯色，X線暗盒成像。重復(fù)6次實驗，采用Image J（1.44P版本）軟件測量顯影條帶灰度，以目的蛋白與對應(yīng)內(nèi)參蛋白灰度比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 iNOS免疫熒光染色結(jié)果組間iNOS陽性BV-2細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=8.09，P＜0.01），其中Control組iNOS陽性BV-2細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞突起較多，呈細(xì)長狀（圖1-A箭頭）；被LPS刺激后，大量 BV-2細(xì)胞呈iNOS陽性，與Control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (表 1，P＜0.01)，iNOS表達(dá)于BV-2細(xì)胞胞體和突起，同時部分細(xì)胞胞體變圓鈍，突起變少變粗短（圖1-B箭頭）；經(jīng)3 μg/mL 和 5 μg/mL 濃度 Gla 分別處理后，iNOS陽性BV-2細(xì)胞數(shù)量均較LPS組有明顯減少 (表1，P＜0.01)，同時胞體逐漸縮小，細(xì)胞突起增多（圖1-C，D箭頭）。但兩個不同濃度藥物處理組iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1，P＞0.05)。

圖1 免疫熒光技術(shù)檢測iNOS在BV-2細(xì)胞的表達(dá) (400×)。 A為Control組，箭頭示突起細(xì)長；B為LPS組，箭頭示胞體圓鈍，突起粗短；C和D分別為3和5 μg/mL Gla處理組，箭頭示胞體縮小，突起增多。

2.2 iNOS和NF-кB p65免疫蛋白印跡檢測結(jié)果各組細(xì)胞胞漿 iNOS 蛋白（F=7.89，P＜0.01）和胞核NF-кB p65 蛋白（F=6.12，P＜0.01）水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Control組BV-2細(xì)胞胞漿中有少量iNOS蛋白表達(dá)，胞核中NF-кB p65蛋白含量也很少（圖2，表 1）；經(jīng) LPS刺激后，BV-2細(xì)胞胞漿中iNOS 蛋白表達(dá)量急劇增加（圖 2，表 1，P＜0.01），同時胞核中NF-кB p65蛋白含量也顯著增加（圖2，表 1，P＜0.01）；給予 3 μg/mL 和 5 μg/mL Gla 處理后，胞漿中iNOS蛋白表達(dá)量均較LPS組有明顯下降（圖 2，表 1，P＜0.01），同時胞核 NF-кB p65蛋白含量也均較LPS組有一定程度降低（圖2，表1，P＜0.01）；但兩個濃度組細(xì)胞胞漿iNOS蛋白和胞核NF-кB p65蛋白含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（圖 2，表 1，P＞0.05）。

3 討論

圖2 免疫蛋白印跡檢測BV-2細(xì)胞胞漿iNOS和胞核NF-кB p65表達(dá)

表1 Gla對BV-2細(xì)胞iNOS和NF-кB p65蛋白表達(dá)影響(n=6，±s)

表1 Gla對BV-2細(xì)胞iNOS和NF-кB p65蛋白表達(dá)影響(n=6，±s)

1)與 Control組比較，P＜0.01；2)與 LPS 組比較，P＜0.01

組別 蛋白相對表達(dá)量Control組LPS組3 μg/mL Gla 處理組5 μg/mL Gla 處理組iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量（光密度值）10.144±1.124 685.447±9.9411)346.386±8.5232)318.289±6.2742)iNOS 0.081±0.014 0.856±0.0521)0.462±0.0242)0.424±0.0312)NF-кB p65 0.033±0.007 0.264±0.0091)0.154±0.0062)0.121±0.0042)

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)炎癥主要的效應(yīng)細(xì)胞，尤以中腦黑質(zhì)分布最為密集[5]。PD患者尸檢標(biāo)本發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)存在小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨脱装Y指標(biāo)大幅升高[1,5]。iNOS是炎癥反應(yīng)過程中重要的限速酶，NOS基因突變的小鼠可明顯抵抗PD造模劑的神經(jīng)毒性。我們用LPS處理體外培養(yǎng)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)iNOS，與體內(nèi)研究的實驗結(jié)果一致[6]。iNOS大量表達(dá)是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志，其可導(dǎo)致大量炎性因子和氧化分子產(chǎn)生，造成DA能神經(jīng)元繼發(fā)損害[3]。形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：被LPS刺激后，大量BV-2細(xì)胞胞體和突起均呈iNOS陽性，且胞體變圓鈍，突起變少變粗短，也提示小膠質(zhì)細(xì)胞正從靜止的分支樣向活化的阿米巴樣轉(zhuǎn)變。鑒于NF-кB是炎癥信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵核心因子，且iNOS基因啟動子受NF-кB亞單位 p65調(diào)控[7]，我們檢測了BV-2細(xì)胞核內(nèi)NF-кB p65蛋白表達(dá)情況，以便明確iNOS表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BV-2細(xì)胞胞質(zhì)iNOS蛋白表達(dá)增加同時，伴有胞核內(nèi)NF-кB p65蛋白含量升高。提示LPS可能通過激活BV-2細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)NF-кB，促進(jìn)p65亞單位解離，并轉(zhuǎn)位入核，啟動iNOS基因表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

傳統(tǒng)中藥甘草常被用于治療PD的中藥復(fù)方[8]。Gla是甘草所含兩大組分中最具生物活性的一種。本課題組和其他團(tuán)隊用Gla處理PD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其可顯著減少黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的丟失[4，8]，本文繼續(xù)探討其作用的分子機(jī)制。在肺炎、腸炎、關(guān)節(jié)炎等疾病研究中，甘草及其提取物表現(xiàn)出良好抗炎活性[9]。我們著重研究體外Gla對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。根據(jù)文獻(xiàn)[10]選用對細(xì)胞較為安全的3 μg/mL和 5 μg/mL濃度 Gla處理體外培養(yǎng)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示兩種濃度的Gla均可明顯減少LPS誘導(dǎo)的iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量增加和胞漿內(nèi)iNOS蛋白表達(dá)水平升高，提示Gla對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS表達(dá)和細(xì)胞活化具有抑制作用。形態(tài)學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)經(jīng)Gla處理后小膠質(zhì)細(xì)胞胞體減小，突起增多，向靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變。有研究也證實用甘草提取物處理體外培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞 （與小膠質(zhì)細(xì)胞屬同一種類）可抑制炎性因子分泌[11]。同時我們也注意到：3和5μg/mL濃度Gla對BV-2細(xì)胞iNOS表達(dá)影響不具有顯著性差異，提示3 μg/mL濃度Gla即可發(fā)揮較大的生物學(xué)效益。此外甘草提取物還被報道可阻斷內(nèi)皮細(xì)胞NF-кB信號通路[12]。我們對比了 Gla處理前后 BV-2細(xì)胞核NF-кB p65蛋白含量的變化，結(jié)果顯示Gla在減少LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞iNOS表達(dá)同時，也降低了胞核NF-кB p65蛋白含量，提示Gla對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NF-кB激活具有抑制作用。

綜上所述，我們的研究結(jié)果說明Gla可能通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞NF-кB激活，調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的免疫炎癥損害。但是Gla對NF-кB信號通路的具體作用靶點和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以及Gla對PD患者的實際臨床應(yīng)用效果尚有待于進(jìn)一步研究確定。