何旭輝，聞 俊,2*，周婷婷,2

[1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海 200433; 2.上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點實驗室，上海 200433]

中藥梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis.的干燥成熟果實，味苦、寒，歸心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，主要用于熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍等癥[1]。梔子中主要的活性成分為環(huán)烯醚萜苷類(iridoid glycosides,IGs)，具有抗炎、解熱、利膽和輕瀉等藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛。目前已從梔子中分離得到IGs成分50多種，其中京尼平苷(也稱梔子苷)、西紅花苷和黃酮等成分含量較高[2]。作為藥食兩用的中藥材，梔子的臨床應(yīng)用安全性日益受到關(guān)注。京尼平苷是梔子中IGs成分的代表，可以提高谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性，增加肝臟中谷胱甘肽的含量，具有肝保護作用；但同時京尼平苷的攝入量過大或時間過長，也會導(dǎo)致肝損傷[3,4]。因此，建立對京尼平苷為代表的IGs成分的分析方法，有助于對梔子及其中藥復(fù)方中IGs成分含量進行準(zhǔn)確測定；同時為含有梔子的中藥復(fù)方藥動學(xué)研究及探索IGs成分的體內(nèi)處置提供依據(jù)，對含有梔子的中藥復(fù)方的臨床合理用藥和安全性評價均具有重要意義。

1 IGs成分的定量分析方法

梔子中IGs成分較多，結(jié)構(gòu)相近，可以采用紫外光譜法對其總含量進行測定。周婷婷等[5]以京尼平苷作為對照品，以30%甲醇為溶劑，在238 nm處測定吸光度，結(jié)果顯示梔子提取物中總IG以京尼平苷計達(dá)56.50%。該方法對于以總IG含量為指標(biāo)，進行含梔子中藥復(fù)方的活性成分的提取及純化工藝的考察具有重要意義。Han等[6]用HPLC-DAD-ESI-MS法對17個產(chǎn)地的梔子藥材中9個IGs成分進行了含量測定，發(fā)現(xiàn)京尼平苷、京尼平苷酸、去乙酰車前草酸甲酯等IGs成分對藥材質(zhì)量的影響較大。劉聰?shù)萚7]采用超高效液相色譜法(UPLC)對44批梔子藥材進行指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)湖北、江西、湖南所產(chǎn)的梔子質(zhì)量較好，不同產(chǎn)地梔子中京尼平苷和西紅花苷的含量有明顯差異。何國振等[8]采用HPLC法對不同成熟期的梔子果實進行定量分析，發(fā)現(xiàn)在梔子果實成熟過程中京尼平苷含量先下降再上升最后下降，最高可達(dá)約6%，表明不同采收期的梔子中IGs成分含量具有明顯差異。全青期為京尼平苷和西紅花苷-1的最佳采收期，根據(jù)果實顏色及時采收才能獲得高含量的目標(biāo)活性成分。沈晨等[9]采用UPLC法對生梔子和焦梔子中的京尼平苷進行含量測定，結(jié)果顯示，炒焦過程影響京尼平苷的穩(wěn)定性，焦梔子中京尼平苷含量較生梔子低。 由此可見， 不同采收期、不同產(chǎn)地以及炮制過程均會使梔子中IGs成分的含量發(fā)生改變， 從而可能影響到臨床用藥的安全性和有效性。 因此在質(zhì)量控制環(huán)節(jié)， 多成分定量結(jié)合指紋圖譜分析的策略， 可以對梔子或含有該藥材的中藥制劑進行全面、有效的質(zhì)量評價。

1.1 HPLC法 IGs成分具有較大的極性，采用HPLC法對其進行分離、分析，主要采用反相C18色譜柱，流動相中有機溶劑占比普遍較低，以延長待測成分的保留時間；水相中均加入一定量的酸性改性劑，以改善分離效果。由于IGs成分復(fù)雜，含量差異較大，因此以紫外光檢測時，一般檢測其中含量最高的京尼平苷。最近發(fā)表的文獻(xiàn)中對梔子中IGs成分具有代表性的HPLC分析條件見表1。

1.2 LC-MS法 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)將色譜的高效能分離與質(zhì)譜的高靈敏度、強專屬性檢測結(jié)合起來，通過對化學(xué)成分色譜峰的保留時間、一級和二級質(zhì)譜圖的鑒定，并與已知對照品數(shù)據(jù)進行比較，從而實現(xiàn)對多種化學(xué)成分的同時定性鑒別[6,14]，主要用于生物樣品中IGs成分測定。IGs成分在正離子模式下除了產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M+H+]之外，還可能產(chǎn)生[M+Na+]峰、[M+NH4+]峰；在負(fù)離子模式下，會產(chǎn)生[M+HCOO-]峰或[M+CH3COO-]峰，在定量過程中需要根據(jù)流動相添加劑分辨最佳母離子。IGs成分中的同分異構(gòu)體，如羥異京尼平苷、雞屎藤次苷甲酯和去乙酰車前草酸甲酯，具有相同的裂解規(guī)律[15]，因此無論采用何種模式檢測，都需要對上述成分實現(xiàn)基線分離[16,17]。

IGs成分具有較好的水溶性，主要采用蛋白沉淀法和固相萃取法對血漿樣品進行前處理。Qu等[16]用乙腈作為蛋白質(zhì)沉淀劑，提取大鼠血漿中6種IGs成分，蛋白質(zhì)沉淀過程中加入0.1%甲酸，可以有效破壞IGs成分與蛋白質(zhì)的結(jié)合，獲得較高的提取回收率。Zeng等[18]采用含10 mg/ml維生素C的甲醇沉淀蛋白質(zhì)，然后加入無水硫酸鎂去除過多水份，再加入C18填料吸附脂溶性干擾物質(zhì)，可以提高京尼平苷和京尼平苷酸的萃取效率，降低基質(zhì)效應(yīng)，該法被稱為單管多雜質(zhì)沉淀萃取(single-tube multi-impurity precipitation extraction，SMIPE)。Zheng等[19]采用不同固相萃取填料對血漿中京尼平苷酸進行萃取，發(fā)現(xiàn)弱陽離子交換柱可以達(dá)到80%的提取回收率，而C2、C8和C18固相萃取填料的提取回收率非常低。對于尿液樣品，Chen等[20]采用甲醇稀釋，離心取上清液揮干；對于勻漿后的組織樣品，采用甲醇沉淀蛋白質(zhì)，再將上清液取出揮干；上述提取殘渣用乙腈-水-甲酸(50∶50∶0.1)復(fù)溶后，用LC-MS法分析，生物樣品中的京尼平苷及其代謝產(chǎn)物京尼平的最低定量限可低至0.5 ng/ml。近年來發(fā)表的文獻(xiàn)中定性鑒別和定量測定IGs成分的具有代表性的LC-MS法分析條件見表2。

SIM：選擇離子監(jiān)測；MRM：多反應(yīng)監(jiān)測；SRM：選擇反應(yīng)監(jiān)測

2 梔子中IGs成分的藥動學(xué)研究進展

梔子化學(xué)成分復(fù)雜，單用或與其他中藥配伍使用，在劑量上沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此進入體內(nèi)后，IGs成分的處置也會有所不同。目前，IGs成分的藥動學(xué)研究主要以口服給藥方式為主，研究藥物有京尼平苷、京尼平苷酸等單體，梔子提取物，以及梔子大黃湯、梔子豉湯、醒腦靜口服液等復(fù)方制劑。

2.1 吸收 Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃給予京尼平苷100 mg/kg后，達(dá)峰時間(tmax)為(0.50±0.03) h，峰濃度(cmax)為(1.40±0.24) μg/ml，消除半衰期(t1/2)為(3.55±0.69) h，AUC為(6.76±1.23) μg·h·ml-1，表明京尼平苷口服吸收較快，與靜脈注射給藥10 mg/kg相比，口服給藥的絕對生物利用度約為9.67%。Cheng等[29]研究大鼠灌胃給予京尼平苷、梔子提取物和梔子豉湯提取物(以京尼平苷計200 mg/kg)，發(fā)現(xiàn)京尼平苷的tmax約為30 min，cmax分別為(0.26±0.10)、(1.02±0.60)、(0.97±0.30) μg/ml，AUC分別為(32.07±15.63)、(245.05±85.13)、(205.93±40.41) μg·min·ml-1，其絕對生物利用度分別為4.23%、32.32%和 27.17%。單體化合物京尼平苷給藥后在體內(nèi)消除較快，暴露程度較低，而梔子提取物和梔子豉湯復(fù)方制劑給藥后，京尼平苷的體內(nèi)血藥濃度較高，說明中藥提取物或復(fù)方制劑給藥后會增加京尼平苷的吸收，這種吸收可能與同時給藥的化學(xué)成分抑制了P-糖蛋白從而減少了京尼平苷的外排有關(guān)[30]。研究還發(fā)現(xiàn)，梔子豉湯給藥后京尼平苷的AUC略小于梔子提取物，這可能是由于淡豆豉中的異黃酮抑制了IGs成分的吸收。同樣，梔子豉湯給藥后，體內(nèi)京尼平苷酸的AUC也略小于梔子藥材給藥[31]。在膽汁淤積肝損傷模型大鼠體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃梔子大黃湯后，體內(nèi)京尼平苷和京尼平龍膽雙糖苷的cmax、AUC和t1/2均顯著大于正常大鼠相應(yīng)的參數(shù)，這可能與膽汁淤積造成肝損傷，引起肝藥酶活性下降有關(guān)，使得IGs在體內(nèi)作用時間更長，治療作用增強[24]。

2.2 分布 吳歡等[32]給大鼠灌胃60 mg/kg京尼平苷，檢測各組織中藥物濃度，發(fā)現(xiàn)腎臟最高，其他依次為肝、脾和腦。Wang等[28]給大鼠灌胃京尼平苷100 mg/kg，各組織AUC測定結(jié)果顯示：腎>脾>肝>心>肺>大腦，表明京尼平苷在腎臟中分布較多，這與其具有較大水溶性，易于從尿液中以原形排泄有關(guān)。將京尼平苷制成固體脂質(zhì)體納米制劑后，以100 mg/kg劑量灌胃大鼠，不僅其t1/2顯著延長至約35 h，各主要組織中的濃度也顯著增加，尤其是在心、腦、肝中的組織分布，這將有助于提高藥物在這些靶器官的治療效果[33]。Qu等[17]采用腦部微透析取樣技術(shù)測定了大鼠給予梔子豉湯后5種IGs成分在腦組織中的分布，各成分均在5.8～7.4 h達(dá)到最高組織濃度，t1/2為0.8～2.1 h，說明上述成分向腦分布較慢，且消除較快。各成分在海馬和下丘腦的組織濃度高于在大腦皮層、紋狀體、延髓和小腦的濃度，提示IGs成分入腦后主要累積在神經(jīng)遞質(zhì)受體豐富的海馬部分，起到抗抑郁的作用。Xu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，冰片與梔子藥對提高了京尼平苷的血藥濃度，冰片-梔子藥對可有效提高腦組織中京尼平苷的濃度[35]，鼻腔給予該藥對后，腦組織中京尼平苷相對于靜脈給藥的生物利用度可達(dá)86.97%。體外實驗表明，冰片可以結(jié)合到細(xì)胞膜表面，改善細(xì)胞膜的通透性，增加細(xì)胞膜磷脂分子鏈的有序排列，當(dāng)透過物質(zhì)為水溶性物質(zhì)時，冰片可以打開細(xì)胞間連接，減少物質(zhì)與磷脂分子的碰撞，提高藥物通過細(xì)胞連接的速率[36]。所以腦中風(fēng)大鼠模型灌胃給予醒腦靜(含梔子、冰片、麝香、郁金)液體制劑后，腦組織中可以檢測到京尼平苷、京尼平龍膽雙糖苷和京尼平苷酸，且具有較高的組織濃度[26]。

2.3 代謝 梔子及其復(fù)方制劑以口服給藥為主，京尼平苷在胃液中較穩(wěn)定，進入腸道后受腸道菌群作用脫去糖基生成京尼平；羥異京尼平苷則在胃液中發(fā)生異構(gòu)化，生成雞屎藤次苷甲酯和去乙酰車前草酸甲酯，然后在腸道內(nèi)進一步生成脫糖基代謝產(chǎn)物[37]。京尼平龍膽雙糖苷同樣在腸道內(nèi)脫去一分子糖生成京尼平苷，并進一步生成京尼平[38]?？梢?，梔子中的IGs成分首先經(jīng)胃腸道發(fā)生代謝，主要為脫糖基代謝，生成相應(yīng)苷元，如京尼平或京尼平酸；之后京尼平還可以在腸道內(nèi)發(fā)生N-雜環(huán)化反應(yīng)，由氮取代2位的氧，生成京尼平堿[39]。吸收入血的苷及苷元會在肝臟中發(fā)生廣泛的Ⅱ相結(jié)合反應(yīng)，生成葡萄糖醛酸結(jié)合物、硫酸結(jié)合物，有的苷元會再次結(jié)合葡萄糖，轉(zhuǎn)化成苷，通過膽汁分泌到腸道，形成腸肝循環(huán)。除了結(jié)合反應(yīng)外，IGs母核還會在肝臟中發(fā)生去羥基、開環(huán)及還原反應(yīng)，生成相應(yīng)的代謝產(chǎn)物[40,41]。

急性毒性實驗顯示，大鼠灌胃861 mg/kg京尼平苷后，24～48 h開始出現(xiàn)肝臟毒性；細(xì)胞毒性實驗則顯示，腸道代謝產(chǎn)物京尼平的毒性遠(yuǎn)大于京尼平苷。京尼平具有明顯的肝細(xì)胞毒性作用，是梔子致肝毒性的直接物質(zhì)基礎(chǔ)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的線粒體損傷與細(xì)胞凋亡是京尼平引起肝毒性的主要作用機制之一[42,43]。由此可見，含有梔子的復(fù)方制劑給藥后，其劑量大小及共同成分均對腸道菌群有影響，可能改變腸道中IGs成分轉(zhuǎn)化為苷元的過程。因此，今后需要對復(fù)方制劑給藥后的腸道代謝進行研究，探討IGs成分的體內(nèi)代謝途徑，為臨床安全、合理用藥提供必要的基礎(chǔ)。

2.4 排泄 大鼠靜滴熱毒寧注射液后24 h內(nèi)，京尼平苷、京尼平龍膽雙糖苷、斷氧化馬錢子苷、獐牙菜苷和山梔苷的尿液累積排泄量達(dá)70%以上；而斷馬錢子酸僅為7%，這可能與該成分主要在肝臟中發(fā)生氫化代謝有關(guān)；同時京尼平苷酸在尿液中被大量檢測到，這是由于京尼平苷在肝臟中發(fā)生去甲基化反應(yīng)生成京尼平苷酸后隨尿液排泄。膽汁排泄的結(jié)果與尿液排泄相符，京尼平苷酸排泄率最高，而斷馬錢子酸排泄率最低[21]。

梔子中IGs成分的研究，對于探討梔子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理作用機制及毒性具有重要作用。目前針對梔子及其復(fù)方制劑的研究，主要形成了化學(xué)指紋圖譜結(jié)合指標(biāo)性化學(xué)成分定量的評價手段，以確保梔子及其復(fù)方制劑質(zhì)量的安全、可靠。針對梔子IGs成分的體內(nèi)代謝過程研究，已經(jīng)從單一的京尼平苷擴大到其他IGs成分，研究梔子提取物以及不同復(fù)方制劑給藥后，體內(nèi)IGs成分的吸收、分布、代謝、排泄，并結(jié)合病理模型研究IGs在肝損傷、腦卒中、糖尿病等大鼠模型體內(nèi)的處置過程。但是針對梔子復(fù)方制劑的配伍規(guī)律等研究，仍然需要不斷改進分析檢測手段，在上述研究的基礎(chǔ)上，重點深入研究靶器官和靶組織中IGs成分的濃度，結(jié)合其藥效和毒性，實現(xiàn)多靶點、多組分、多效應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，為梔子及其復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用及中藥新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。